【正文】 這些關(guān)鍵技術(shù)不僅將為本項(xiàng)目提供有力支撐，同時(shí)也將產(chǎn)生具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的技術(shù)創(chuàng)新 。除利用市場(chǎng)現(xiàn)有產(chǎn)品外，我們將充分發(fā)揮項(xiàng)目組成員在新型成像技術(shù)方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，發(fā)展 CARS/SRS 顯微技術(shù) ， 解決部分 不易標(biāo)記的 信號(hào)分子動(dòng)態(tài)可視化問(wèn)題； 利用 STED 高分辨 技術(shù) 研究信號(hào)蛋白的空間定位和位移， 利用可視化技術(shù)從事 RNA 干擾 的通量化篩選。通過(guò)對(duì) 時(shí)空動(dòng)態(tài)成像數(shù)據(jù)的降維 與模型結(jié)合，實(shí)現(xiàn)模型參量估計(jì)；通過(guò)模型仿真，預(yù)測(cè)系統(tǒng)性質(zhì)并提交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；通過(guò)考察模型內(nèi)在關(guān)系，提出新理論，闡明 信號(hào)分子微觀隨機(jī)性與細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)穩(wěn)健性的關(guān) 系 。我們?cè)谝陨蠈?shí)驗(yàn)研究中產(chǎn)生了大量關(guān)于鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)及 AdR 信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控的定量數(shù)據(jù)。 4. 信號(hào) 分子微觀 隨機(jī) 性與細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng) 穩(wěn)健性 的關(guān)系 各種細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)構(gòu)成了一個(gè)相互作用的復(fù)雜 系統(tǒng)。同時(shí)，我們將運(yùn)用 基因 敲除 、基因 突變、基因沉默 等技術(shù)，通過(guò)對(duì) 關(guān)鍵 信號(hào) 分子 進(jìn)行遺傳干預(yù)，研究 鈣信號(hào)系統(tǒng)、線粒體 ROS 信號(hào)系統(tǒng)與 AdR 信號(hào)系統(tǒng)之間交互調(diào)控關(guān)系，闡明三者間相互協(xié)調(diào)、維持細(xì)胞信號(hào)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。例如，我們發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)會(huì)激活 ROS， ROS 也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，二者在 ?AdR 激動(dòng)下發(fā)生正反饋，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，我們將研究 AdR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)超氧炫頻率和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響，并找出這種影響的信號(hào)通路，闡明線粒體 ROS 信號(hào)失穩(wěn)態(tài)機(jī)制。 許多病理?xiàng)l件下，線粒體代謝模式發(fā)生顯著變化。 2. 線粒體 ROS 信號(hào)超氧炫及調(diào)控 超氧炫是利用我們 最新發(fā)明 的 超氧陰離子熒光蛋白探針 cpYFP 觀察到的線粒體 ROS 爆發(fā)。但我們最近在一種兒茶酚胺敏感的室性心動(dòng)過(guò)速（ CPVT）的小鼠模型中，觀察到激動(dòng) ?腎上腺素受體 （ AdR）會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生持續(xù)旋轉(zhuǎn)的螺旋波，我們認(rèn)為這是 CPVT 發(fā)生致死性心律失常的關(guān)鍵微觀事件。 在某些病理?xiàng)l件， RyR 與 RyR 之間也可以發(fā)生 CICR，這便形成鈣波。我們發(fā)現(xiàn) ， LCCRyR 間的 CICR 效率較高，但 RyR 與 RyR 之間在正常生理?xiàng)l件下卻幾乎不能耦聯(lián)。 主要研究?jī)?nèi)容： 1. 胞內(nèi)鈣信號(hào)時(shí)空動(dòng)態(tài)及調(diào)控 鈣小星觸發(fā)鈣火花的鈣致鈣釋放（ CICR）是細(xì)胞產(chǎn)生和放大細(xì)胞鈣信號(hào)的基本過(guò)程。 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題： 本項(xiàng)目擬以我們過(guò)去的研究基礎(chǔ)和多學(xué)科優(yōu)勢(shì)為基礎(chǔ)，以細(xì)胞鈣信號(hào)、線粒體 ROS 信號(hào)及相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)蛋白構(gòu)成的信號(hào)體系為 突破口，解決這樣 一個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：細(xì)胞信號(hào)的微觀隨機(jī)動(dòng)態(tài)如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞調(diào)控的系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。這種細(xì)胞和機(jī)體機(jī)能的穩(wěn)定性在生理學(xué)上叫做穩(wěn)態(tài)，在控制理論上稱(chēng)為魯棒性或穩(wěn)健性 （ robustness）。然而，細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)作為一個(gè)整體，其行為具有極強(qiáng)的確定性?？梢暬芯糠椒ǖ膬?yōu)勢(shì)是“ 看”到了細(xì)胞信號(hào)的微觀隨機(jī)過(guò)程。 6. 在動(dòng)物模型上完成相關(guān)機(jī)理的研究實(shí)驗(yàn)；實(shí)現(xiàn)在模式動(dòng)物上的視頻幀率（大于 25 幀 /秒）的高分辨動(dòng)態(tài) SRS 顯微觀察；建立適于活細(xì)胞內(nèi)熒光實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)的數(shù)據(jù)分析和圖像處理方法。 4. 在整體動(dòng)物上驗(yàn)證細(xì)胞多信號(hào)失調(diào)及鈣信號(hào)紊亂與相關(guān)疾病的關(guān)系及機(jī)制，并為發(fā)展防治相關(guān)疾病的藥物創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)。 2. 發(fā)現(xiàn)新的超氧炫關(guān)鍵調(diào)控蛋白，并闡明新的超氧炫信號(hào)調(diào)控機(jī)制 。 1. 闡釋細(xì)胞納米尺度局部控制的病理變化機(jī)制，尋找防治疾病條件下細(xì)胞鈣信號(hào)失穩(wěn)態(tài)的策略；闡明 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)溶酶體鈣通道的調(diào)節(jié)，所導(dǎo)致的胞漿鈣振蕩變化。 5. 結(jié)合細(xì)胞鈣信號(hào)、線粒體 ROS 信號(hào)及相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)蛋白構(gòu)成的信號(hào)體系，完善描述分子寡聚體系多尺度時(shí)空動(dòng)態(tài)隨機(jī)模型；完善基于數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)數(shù)學(xué)模型的研究工作。 3. 進(jìn)一步優(yōu)化可視化研究的分析；結(jié)合課題一、二取得的進(jìn)展，深入闡明信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白與鈣信號(hào)和 ROS 信號(hào)系統(tǒng)的相互調(diào)控。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 五 年 1. 研究心衰等疾病條件下鈣小星觸發(fā)鈣火花 過(guò)程中鈣釋放通道的時(shí)空募集過(guò)程，分析其動(dòng)力學(xué)的差異；研究單線態(tài)氧分子對(duì)溶酶體鈣離子通道的調(diào)節(jié)，所導(dǎo)致的胞漿鈣振蕩變化；研究氧化型通道蛋白結(jié)構(gòu)的何種變化，導(dǎo)致了溶酶體鈣通道功能的改變。 5. 針對(duì)細(xì)胞鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)及相關(guān)信號(hào)蛋白構(gòu)成的信號(hào)體系，提出信號(hào) 分子寡聚體系的介觀穩(wěn)健性原理 。 3. 設(shè)計(jì)核酸模板控制下的雙探針系統(tǒng)，并通過(guò)化學(xué)方法，靈活的改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，獲得多元化的探針；闡述細(xì)胞凋亡過(guò)程中 ROS 和鈣信號(hào)的協(xié)同失穩(wěn)態(tài)的正反饋過(guò)程。 1. 闡釋細(xì)胞鈣致鈣釋放納米尺度局部控制的分子和動(dòng)力學(xué)機(jī)制，以及這種控制對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的重要意義；闡明 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)細(xì)胞線粒體攝鈣蛋白的特異性調(diào)節(jié)，及其所導(dǎo)致的胞漿鈣振蕩變化 。 5. 進(jìn)一步結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究分子寡聚體系介觀穩(wěn)健性行為；從實(shí)際數(shù)據(jù)反演細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型的參數(shù)和分布函數(shù)。 3. 應(yīng)用多元化的核酸模板控制下的雙探針 系統(tǒng)，通過(guò)可視化研究，分析信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)形成和分解過(guò)程；利用該探 針 技 術(shù) 研 究 ROS 激活caspase 和鈣依賴(lài)性蛋白激酶的過(guò)程。研究攝鈣蛋白攝鈣功能的變化，與蛋白氧化修飾的關(guān)系 。 6. 初步掌握兩到三個(gè)基因體外和細(xì)胞的作用機(jī)制證據(jù)；初步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的顯微鏡下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài) 培養(yǎng)和CARS/SRS 的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)；建立共聚焦熒光成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)模型，實(shí)現(xiàn)反卷積方法，提高圖像分辨率。 4. 闡明細(xì)胞多信號(hào)體系相互調(diào)控鈣、 ROS 信號(hào)的分子機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。 2. 超氧炫信號(hào)特 性在代謝疾病中發(fā)生明顯改變，有可能作為 診斷、治療代謝疾病的靶點(diǎn)； 超氧炫信號(hào)特性在神經(jīng)性疾病中發(fā)生明顯改變，有可能作為 診斷、治療神經(jīng)性疾病的靶點(diǎn)。 1. 闡明胞膜窖中 G 蛋白、鈣信號(hào)蛋白、激酶、磷酸二酯酶空間募集與局部信號(hào)控制的關(guān)系；闡明細(xì)胞主要表達(dá)的 TRP 通道，及核定位的 TRP 通道。 5. 改進(jìn)分子寡聚體系米氏模型， 刻畫(huà)其亞穩(wěn)態(tài)行為；基于相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)展時(shí)空動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)提取的分析與建模方法；針對(duì)細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型，研究模型參數(shù)和分布函數(shù)的反演方法。 3. 應(yīng)用小分子探針標(biāo)記，標(biāo)記鈣離子信號(hào)和 ROS 信號(hào)分子；將鈣離子探針與線粒體蛋白特異結(jié)合，對(duì)線粒體 ROS 與鈣相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究 。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 以 ?2 腎 上 腺 素 受體 介 導(dǎo) 的cAMPPKA 為例，研究 G 蛋白耦聯(lián)受體局部調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣信號(hào)的分子機(jī)制；研究細(xì)胞主要表達(dá)的TRP 通道類(lèi)型及亞細(xì)胞定位；研究 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)細(xì)胞Ca2+ATPase 功能的調(diào)節(jié)，及所導(dǎo) 致的 Ca2+ATPase 氧化修飾 。 5. 分子寡聚體系米氏模型理論；刻畫(huà)米氏模型介觀穩(wěn)定性的控制和優(yōu)化參數(shù)；改進(jìn)的細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)數(shù)學(xué)模型以及進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。 3. 發(fā)展各類(lèi)小分子標(biāo)記技術(shù)；揭示AdR 局部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。 1. 闡明鈣釋放通道分子性質(zhì)與鈣火花及其自組織時(shí)空動(dòng)力學(xué)的關(guān)系、以及 CPVT 分子病理機(jī)制；闡明 ROS 信號(hào)對(duì)細(xì)胞 胞漿鈣振蕩發(fā)生及 其振蕩模式的影響，闡述 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)細(xì)胞表面 G 蛋白耦聯(lián)受體所介導(dǎo)的信號(hào)通路（鈣振蕩通路）的調(diào)控 。 5. 對(duì)分子寡聚體系米氏模型進(jìn)行數(shù)值模擬和理論分析；基于數(shù)值模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) , 發(fā)展從時(shí)空動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)提取 穩(wěn)健行為的分析與建模方法；改進(jìn)細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型，并與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。 3. 應(yīng)用非天然氨基酸標(biāo)記、 Sortase標(biāo)記技術(shù)，對(duì)磷酸二酯酶高特異性標(biāo)記；對(duì) AdR 募集磷酸二酯酶寡聚復(fù)合體進(jìn)行可視化研究。研究 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)細(xì)胞表面 G 蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的鈣信號(hào) 的調(diào)控作用 。確定適合大規(guī)模細(xì)胞的種類(lèi)、 ROS 信號(hào)檢測(cè)或示蹤探針以及 siRNA 轉(zhuǎn)染的參數(shù)等；建立不少于 500 條 siRNA 的文庫(kù)；完成 CARS 顯微鏡的建設(shè)，獲取穩(wěn)定的 CARS 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)脂類(lèi)分子和亞細(xì)胞脂肪顆粒的實(shí)時(shí)觀察。 5. 分子寡聚體系米氏模型；從時(shí)空動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)提取某些低維流形和穩(wěn)健行為表示；細(xì)胞鈣信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué) 模型、初步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。 3. 發(fā)展光激活熒光蛋白等特異標(biāo)記技術(shù)；建立在大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有普適性的熒光蛋白標(biāo)記方法，發(fā)展新的活體標(biāo)記平臺(tái)； 建立并完善 SRET技術(shù) ，實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白相互作用的檢測(cè)。 1. 闡明 細(xì)胞鈣信號(hào)自組織過(guò)程及其生理和病理意義。 5. 建立分子寡聚體系相互作用的米氏方程組；發(fā)展針對(duì)時(shí)空動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析與建模工具；研究細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型，與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證。 3. 構(gòu)建光激活熒光蛋白與鈣致鈣釋放蛋白復(fù)合體中有關(guān)信號(hào)蛋白的融合載體； 通過(guò)對(duì)分子聚集的時(shí)空動(dòng)態(tài)的可視化研究，分析鈣致鈣釋放蛋白復(fù)合體 與 RyR 的關(guān)系。 四、年度計(jì)劃 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 建立小鼠鈣信號(hào)異常病理模型，研究細(xì)胞鈣振蕩和螺旋波的時(shí)空動(dòng)態(tài)。 課題四、五在上述分析的基礎(chǔ)上，分別以遺傳干預(yù)等實(shí)驗(yàn)手段、建模仿真等理論手段，研究課題一、二、三中信號(hào)動(dòng)態(tài)相互調(diào)控的穩(wěn)態(tài)整合，重點(diǎn)揭示微觀隨機(jī)信號(hào)形成系統(tǒng) 穩(wěn)健性的基本原理，在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上產(chǎn)生理論升華。課題三密切配合課題一、二，研究關(guān)鍵信號(hào)蛋白的分子動(dòng)態(tài)和相互作用。 承擔(dān)單位： 北京大學(xué) 課題 組長(zhǎng) ： 席建忠 學(xué)術(shù)骨干： 謝曉亮、黃巖誼、熊春陽(yáng) 經(jīng)費(fèi) 比例： 22% 5. 課題間的關(guān)系 各課題 圍繞 細(xì)胞信號(hào) 動(dòng)態(tài)這一 國(guó)際前沿科學(xué)問(wèn)題 ， 在 研究過(guò)程中緊密配合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，資源共享。通過(guò)利用大規(guī)模 RNA 干擾篩選技術(shù)，篩選和確定在這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，利用共聚焦顯微鏡、 CARS、 SRS 等高分辨三維成像技術(shù)， 進(jìn)行時(shí)空動(dòng)態(tài)示蹤，詳細(xì)闡釋關(guān)鍵分子的作用機(jī)制，在光學(xué)顯微觀察技術(shù)上，引入相干拉曼散射作為成像的新模態(tài)，可以擺脫標(biāo)記的困難，在顯微圖像的分析上，引入新的圖像處理方法，提高可靠性。本課題基于項(xiàng)目組深入的研究工作和新穎的高分辨、高通量時(shí)空動(dòng)態(tài)成像技術(shù)，提出了具有創(chuàng) 新性的研究方案，有關(guān)研究對(duì)于深入認(rèn)識(shí)生物功能多樣性和穩(wěn)定性具有重要意義。本課題通過(guò)圍繞細(xì)胞鈣 信號(hào)、線粒體 ROS 信號(hào)及相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)蛋白構(gòu)成的信號(hào)體系，以生物物理原理和統(tǒng)計(jì)、數(shù)學(xué)理論為基礎(chǔ)，以理論分析、數(shù)值模擬和針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與驗(yàn)證為方法，通過(guò)對(duì)不同時(shí)空尺度變化的時(shí)空動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)的分析建立理論模型，從控制和優(yōu)化的角度研究系統(tǒng)的性質(zhì)。 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所、中南民族大學(xué) 課題 組長(zhǎng) ： 姬 廣 聚 學(xué)術(shù)骨干： 劉慶華、苗林、馮涓涓 經(jīng)費(fèi)比例： 14% 課題 5 信號(hào)分子時(shí)空隨機(jī)性與介觀行為穩(wěn)健性 研究?jī)?nèi)容 ： 生命科學(xué)正在進(jìn)入分子和細(xì)胞水平的定量研究，探索分子和細(xì)胞行為的理論模型具有重要意義。本課題將制備基因干預(yù)動(dòng)物模型，結(jié)合分子生物 /生物化學(xué)、電生理及成像技術(shù)等現(xiàn)代技術(shù)，深入研究細(xì)胞多信號(hào)的相互調(diào)控，并闡明其整合機(jī)制 .主要研究?jī)?nèi)容有：可遺傳熒光分子探針動(dòng)物模型；鈣信號(hào)與 ROS 信號(hào)的交互調(diào)控；關(guān)鍵信號(hào)蛋白的遺傳干預(yù)。 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院植物研究所、北京大學(xué) 課題 組長(zhǎng) ： 林金星 學(xué)術(shù)骨干： 何川、李笑宇 經(jīng)費(fèi)比例： 18% 課題 4 細(xì)胞多信號(hào)體系的整合調(diào)控 研究?jī)?nèi)容 ： 細(xì)胞生命活動(dòng)功能受到眾多信號(hào)分子的調(diào)控，如 RyR、 IP3R等鈣通透性膜通道、 AdR 等受體及 、 Yap、 ROS、 DJ1 等調(diào)節(jié)蛋白。 研究 目標(biāo)： 通過(guò)設(shè)計(jì)和建立新的熒光蛋白表達(dá)體系及小分子熒光標(biāo)記體系，對(duì)鈣致鈣釋放信號(hào)蛋白復(fù)合體 的寡聚狀態(tài) 、 G 蛋白耦聯(lián)受體募集不同亞型磷酸二酯酶的時(shí) 空動(dòng)態(tài)過(guò)程、 ROS 激活 caspase 和鈣依賴(lài)性蛋白激酶 等過(guò)程實(shí)現(xiàn)可視化成像，闡明關(guān)鍵信號(hào)蛋白相互調(diào)控的 分子 機(jī)制。 研究 目標(biāo)： 以超氧炫信號(hào)為基礎(chǔ)，在整體動(dòng)物水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)正常生理代謝過(guò)程及有關(guān)病理過(guò)程中 ROS 信號(hào)的變化及其作用機(jī)制，探討超氧炫信號(hào)用于診斷的可行性。我們最新研究發(fā)明了一種特異于超氧