【正文】 4）整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫文章，投稿，并根據(jù)評審意見進(jìn)行文章的修改，如有需要進(jìn)行試驗(yàn)補(bǔ)充。 八八 、 項(xiàng)項(xiàng) 目目 進(jìn)進(jìn) 度度 安安 排排 （ ） 1）完成體外實(shí)驗(yàn)，即完成對 MMP28 是否影響 MDSCSs 的體外增殖（ MDSCs 細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)）， MMP28 是否影響 MDSCs 的體外分化（ MMP28 刺激后MDSCs 細(xì)胞的的成分是否發(fā)生了變化）， MMP28是否影響 MDSCs 對 T 細(xì)胞的抑制作用（混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）； MMP28 通過怎樣的分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)對 MDSCs 調(diào)控的研究（實(shí)時定量 PCR， ELISA， WB 等對 iNOS， ROS， AGR1 等分子的檢測）； 2）構(gòu)建 MMP28 高表達(dá)和 MMP28 表達(dá)被干涉的重組腫瘤細(xì)胞（根據(jù)文獻(xiàn)，確定高表達(dá)和低表達(dá) MMP28 的腫瘤細(xì)胞，分別構(gòu)建編碼小鼠 MMP28 的載體和編碼針對MMP28的 shRNA 的載體，分別包裝病毒，轉(zhuǎn)染相應(yīng)腫瘤細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 的腫瘤細(xì)胞）。 同時課題組成員均為受過系統(tǒng)科研訓(xùn)練并且具有扎實(shí)的免疫學(xué)或分子生物學(xué)知識的博士，這為項(xiàng)目的開展提供了技術(shù)上的支持。在此基礎(chǔ)上我們已開始進(jìn)行 MMP28 對 MDSCs 體外增殖實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)。 MMP28在腫瘤組織中高表達(dá)并具有潛在的免 疫抑制作用使得它成為調(diào)控 MDSCs 的一個極具潛力的分子，但是相關(guān)研究尚未見報(bào)導(dǎo)，本課題的創(chuàng)新點(diǎn)即在于首次闡明 MMP28 在調(diào)控 MDSCs 中的作用。 同時我們的課題小組的成員既有長期工作在臨床的腫瘤內(nèi)科醫(yī)生，又有熟悉分子生物學(xué)和免疫學(xué)的博士碩士，這為課題的實(shí)際可行提供了技術(shù)上的保證。 特別是 已有的研究表明 MMP28 的在胃癌，結(jié)直腸癌 ,胰腺癌等多種腫瘤組織的高表達(dá)，并 且 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 型巨噬細(xì)胞的方向極化 。 3. 可可 行行 性性 分分 析析 腫瘤免疫逃逸的存在是制約腫瘤免疫療法成功的限速因素之一， MDSCs 在腫瘤免疫逃逸中的作用 已被得到廣泛的接受。 ② 免疫組化檢測腫瘤組織中的 MDSCs。 7）構(gòu)建荷瘤小鼠 將步驟 6 中的重組細(xì)胞以及他們對應(yīng)的對照細(xì)胞（未進(jìn)行轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞）以 1X106背部皮下接種于 BABL/c 小鼠，構(gòu)建荷瘤小鼠模型。 6）構(gòu)建 MMP28 高表達(dá)或低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞 結(jié)合文獻(xiàn)，對相關(guān)腫瘤細(xì)胞中 MMP28的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。 5） MMP28 調(diào)控 MDSCs 的分子機(jī)制研究 用 Real time PCR,ELISA 和 WB的方法對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測 AGR1,iNOS,ROS,JAKSTAT3。同時 ELISA 檢測培養(yǎng)上清中的 IFNγ 水平 (Ramp。antiCD3/CD28 (Invitrogen, Carlsbad, CA)刺激 T cell 的增殖。檢測的細(xì)胞及其相應(yīng)的分子標(biāo)記如下： Group Cell type Marker 1 MDSCs Gr1+CD11b+ 2 DCs CD11c+IAb+ 3 Mature DCs CD11c+IAb+ CD86+ 4 Macrophages F4/80+ 5 Granulocytes Gr1+CD11b 4） MMP28 對 MDSCs 功能的影響（對 T 細(xì)胞的抑制作用） 從小鼠的脾臟分離 T 細(xì)胞（用 antiCD8 beads from Miltenyi Biotec, Germany）并用 CSFE 標(biāo)記（ 3umol/L， Sigma）后以每孔 2X105 的細(xì)胞數(shù) 種于圓底的 96 孔板中。 2)觀察 MMP28 是否影響 MDSCs 的體外增殖 將上述 MDSCs 以 5X106/孔種植于 6 孔板，按一下條件分組進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察 MDSCs 的增殖情況。 ④ PBS 洗滌細(xì)胞 1 次后，加入 10ml 紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。 ② 將完整的脛骨和股骨放入 70%酒精中浸泡 5min 后，放入 10ml 冰的 PBS 中。 論文發(fā)表和專利申請： 發(fā)表 SCI 論文 12 篇，申請國家發(fā)明專利 1 項(xiàng)。 基礎(chǔ)理論方面： 明確 MMP28 是否在調(diào)控 MDSCs 增殖、分化和功能中發(fā)揮了作用 ，如果是，其是通過怎樣的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。為了研究我 們的設(shè)想是否成立， 我們擬從細(xì)胞水平和整體動物水平觀察 MMP28 對 MDSCs 增殖、分化和功能作用。但是目前關(guān)于 MDSCs 增殖、分化以及遷移的具體分子機(jī)制還未得以詳細(xì)闡明。 MDSCs 與腫瘤的大小和惡性程度有一定的相關(guān)性，同時這些 MDSCs 誘導(dǎo)的免疫抑制也是導(dǎo)致腫瘤免疫治療失敗的重要原因之一。如 Gr1+CD11b+細(xì)胞在正常小鼠脾臟中占 2%4%，而在荷瘤小鼠的脾臟內(nèi)，該群細(xì)胞高達(dá) 20%40%。正常情況下， MDSCs 可以分化為巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。繼 DCreg 和 TAM 之后，近年來另一群與腫瘤相關(guān)的發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞，髓樣抑制性細(xì)胞（ MDSCs）引起了臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)研究者的強(qiáng)烈關(guān)注。對腫瘤免疫逃逸機(jī)制的闡明不僅有助于發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤治療的靶點(diǎn)，而且有可能提高腫瘤免疫治療的效果。 關(guān)于 MMP28 與 MDSCs 的 關(guān)系研究尚未見報(bào)道 ，故本課題擬研究 MMP28 對 MDSCs 的作用，對該問題的闡明不僅有助于更好地解釋腫瘤免疫逃逸的機(jī)制，并且可為以 MDSCs 為靶向的腫瘤治療提供新的策略，從而 可能將腫瘤的免疫治療方法提高到一個新水平。同時最近的研究