【正文】 展望：巨大芽孢桿菌 L19 的氨肽酶具有開發(fā)價值，其產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酶條件等仍需進一步研究，以便更好地應(yīng)用于去除呈味肽的苦味。本次試驗探索了羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的工藝條件，可為羅非魚下腳料綜合利用提供有價值的參考。巨大芽孢桿菌 L19 的氨肽酶具有開發(fā)價值，其產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酶條件等仍需進一步研究，以便更好地應(yīng)用于去除呈味肽的苦味。由表 2 可見，經(jīng)過氨肽酶酶解 10 h，呈味肽溶液中游離氨基酸的總量明顯增加，游離氨基酸增加的總量達(dá) mg/L；其中，甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等疏水氨基酸的增加量較為明顯，疏水氨基酸的增加量約占 %，說明氨肽酶可以去除呈味肽的部分疏水氨基酸，有利于苦味的脫除。從盡可能節(jié)省酶用量和時間的角度考慮， 104 U/g 和 10 h 分別被優(yōu)選為最佳的酶用量和時間，此條件下的游離氨基酸濃度達(dá)到 5970 mg/L。 45 50 55 60 65 703000350040004500500055006000游離氨基酸濃度（mg/L）溫度（ ? C ） 圖 4 溫度 對氨肽酶酶解的影響 酶用量與時間對氨肽酶酶解的影響 在 pH 、 60 ℃ 的條件下，不同用量氨肽酶在酶解過程中的變化曲線如圖5所示?？梢钥闯觯薮笱挎邨U菌 L19 所制備的氨肽酶屬于堿性蛋白酶，在堿性條件下具有良好的酶解能力。g/L。 總氮的測定采用微量 凱氏定氮法（按 測定） 。L。 酶用量與時間的優(yōu)選 將氨肽酶的加酶量分別調(diào)節(jié)為 10 4 U/g、 10 4 U/g、 10 4 U/g和 10 4 U/g，根據(jù) 和 的結(jié)果，在最適 pH 和最適溫度下進行振蕩酶解 12 h。 pH 的優(yōu)選 分別將呈味肽濾液的 pH 值調(diào)節(jié)至 、 、 、 、 和 ，加入氨肽酶的酶粉，加酶量為每克底物（固形物）加入 10 4 U 氨肽酶，置于 60 ℃振蕩酶解 12 h。測定前，配制一系列對硝基胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 10 在 405 nm 波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7H 2O g/L。 9 第四章 氨肽酶對呈味肽溶液的脫苦 材料與方法 材料與試劑 羅非魚下腳料（蛋白質(zhì)含量為 %~ %）：來自海南翔泰漁業(yè)有限公司；中性蛋白酶（ 610 4 U/g） ： 購 于 北京奧博星生物科技有限公司 ；巨大芽孢桿菌 L19：篩選于豆腐乳，經(jīng)鑒定，保藏于廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院；氨肽酶凍干粉：利用巨大芽孢桿菌 L19 發(fā)酵制備；其它試劑均為分析純，市售。 對照組： 6ml 的 TrisHcl 緩沖液 + 去離子水 測定組： 6ml 的 TrisHcl 緩沖液 + 酶液 測定方法 40℃水浴預(yù)熱 5min，向 對照組 和 測定組 同時加 26mM LNA 乙醇溶液，準(zhǔn)確反應(yīng) 10min，立即于 405 nm 處比色。 實驗結(jié)果與討論 高產(chǎn)菌種篩選 采用逐步遞進的方式每層都選擇酶活最高的菌株，采用優(yōu)選策略。 將斜面菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接 1 環(huán)斜面菌種，置于 37 ℃ 、 200 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng) 36 h；在冰水浴中，采用 200 w 超聲波細(xì)胞破碎儀對發(fā)酵液進行超聲處理 5 min，再經(jīng) 8000 r/min 離心分離 20 min，取得清液。 發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏 20 g/L，酪蛋白 10 g/L， KH2PO4 1 g/L， Na2HPO4 將經(jīng)富集培養(yǎng)的菌液用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，取一定量涂布平板， 37℃培養(yǎng) 18h,將生長較好，透明圈較大的菌落挑至肉湯斜面上保藏，以供 6 初篩用。 7H2O , NaCl 2, 干酪素平板培養(yǎng)基 干酪素 4g， KH2PO4 ， Na2HPO4 培養(yǎng)基配制 富集培養(yǎng)基 (g/L ) 可溶性淀粉 8,酵母膏 2,干酪素 I0, KH2PO4 1, MgSO4本次試驗探索了羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的工藝條件，可為羅非魚下腳料綜合利用提供有價值的參 考。加酶量為 600 U/g、 800 U/g、 1000 U/g 和 1200 U/g 的 短肽得率最大值分別是 %、 %、 % 和 %，其中加酶量 800 U/g 在酶解 5 h 的短肽得率最高。雖然水解率和短肽得率的最大值在酶解過程的不同時間出現(xiàn)，但兩者畢竟具有一定關(guān)聯(lián)性， 55℃ 的溫度條件有利于酶解，從而同時有利于獲得較高的水解率和短肽得率。圖 2可以看出，溫度對堿性蛋白酶的酶解作用有很大的影響，兩個指標(biāo)均 3 因溫度不同而具有較大的差異， 堿性蛋白酶在 55℃ 時的水解率和短肽得率均為最高。 048121620木瓜蛋白酶 中性蛋白酶 胰蛋白酶 堿性蛋白酶水解率 / % 圖 1 不同蛋白酶對羅非魚下腳料的水解率 液固比的優(yōu)選 在 55℃ 、 、加酶量 800U/g 的條件下，采用 堿性蛋白酶對不同液固比的底物體系進行酶解處理，酶解后的短肽得率如圖 4所示。 pH 和溫度的優(yōu)選 按 1:3的比例將羅非魚下腳料與水混合，采用上述優(yōu)選的蛋白酶，分別在不同的溫度和 pH 下進行酶解，研究溫度、 pH 對水解率和短肽得率的影響，確定制備呈味肽的最佳溫度和 pH。 1 第二章 蛋白酶對羅非魚下腳料的酶解 材料與方法 材料與試劑 羅非魚下腳料來自海南翔泰漁業(yè)有限公司，蛋白質(zhì)含量為 %~%。 本課題的研究目的與意義 本課題將以羅非魚下腳料為原料，利用酶解技術(shù)制備呈味肽，從而探索羅非魚下腳料綜合利用的有效 II 途徑。 羅非魚下腳料綜合利用的現(xiàn)狀 羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦養(yǎng)殖的熱帶亞熱帶經(jīng)濟魚類 ，全球有 85 個國家和地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚。 Bacillus megaterium。利用巨大芽孢桿菌 L19 發(fā)酵制備得到活性為 104 U/mg 的氨肽酶粉劑，以羅非魚下腳料經(jīng)中性蛋白酶所得的呈味肽為氨肽酶酶解底物，經(jīng)酶解試驗確定，最適的 pH、溫度、酶用量和時間為： 、 60℃ 、 104 U/g 和 10h。在最適的條件下，呈味肽溶液的游離氨基酸增量為 mg/L，疏水氨基酸的增加量占 %，苦味基本消失，表明氨肽酶具有良好的水解能力和脫苦能力。 Aminopeptidase。我國是羅非魚養(yǎng)殖及加工的大國，養(yǎng)殖和加工的產(chǎn)量均占世界總產(chǎn)量的 50%以上 [1~2]。為有力降低呈味肽的生產(chǎn)成本及周期做研究的意義。 中性蛋白酶（ 610 4 U/g） 、 堿性蛋白酶（ 210 5 U/g）購 于 北京奧博星生物科技有限公司 ，木瓜蛋白酶（ 110 6 U/g）購 于廣西龐博生物工程有限公司，胰蛋白酶（ 10 6 U/g）購 于北京格源天潤生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純。 實驗結(jié)果與討論 蛋白酶的優(yōu)選 在各種蛋白酶的最適作用條件范圍內(nèi)，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對羅非魚下腳料的水解率如圖 1 所示。對于各個液固比的底物體系，隨著酶解時間的增加，短肽得率首先呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，最大值出現(xiàn)在 5~6 h；在繼續(xù)酶解的過程中，由于部分短肽轉(zhuǎn)化為氨基酸或二肽