生物大分子的制備-資料下載頁
2024-12-30 22:17本頁面
【正文】 層不要太厚，可以使用安瓿并和青霉素小并。用燒杯時液層厚度不要超過 2 cm。 ? ②凍干稀溶液時會得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水紙包住杯口，刺的孔不要過小過少，否則會影響凍干速度。 ? ⑶溶液冰凍： ? 可用干冰 — 乙醇低溫浴速凍，邊凍邊旋轉(zhuǎn)形成很薄的冰凍層，可以大大加快凍干的速度。 ? ⑷凍干： ? ①樣品全部凍干前，不要輕易搖動，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。 ? ②若外霜消失，則說明樣品已凍干，或是僅剩樣品中心的小冰塊，再稍加延長凍干時間即可。 ? ③凍干后要及時取出樣品，以免樣品在室溫下仃留時間過長而失活。 ? ④仃真空泵時要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。 ? ⑤樣品凍干后要及時密封冷藏，以防受潮。 ? ⑥真空泵要經(jīng)常檢查油面和油色，油面過低和油色發(fā)黑，則需換油。 ? 樣品的保存 ? 生物大分子制成品的正確保存極為重要，一旦保存不當(dāng)，辛辛苦苦制成的樣品失活、變性、變質(zhì)，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。 ? 影響生物大分子樣品保存的主要因素有： ? ⑴ 空氣 ：空氣空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化。 ? ⑵ 溫度 ：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高 10℃ ，氧化反應(yīng)約加快數(shù)倍，酶促反應(yīng)增加 1～ 3倍。 ? ⑶ 水份 ：樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。 ? ⑷ 光線 ：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，影響最大，樣品受光催化的反應(yīng)有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。 ? ⑸ 樣品的 pH： 保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定的 pH范圍，正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度十分重要。 ? ⑹ 時間 ：生化和分子生物學(xué)樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。 ?現(xiàn)以保存蛋白質(zhì)和酶為例： ? ⑴ 低溫下保存 ：通常要保存于－ 5℃ ～－20℃ ，－ 70℃ 保存最理想。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時煮沸；胰蛋白酶在稀 HCl中可以耐受 90℃ ；蔗糖酶在 50℃ ～60℃ 可以保持 15 min ～ 30 min不失活。還有少數(shù)酶對低溫敏感，如鳥肝丙酮酸羧化酶。 ? ⑵ 制成干粉或結(jié)晶保存 ：蛋白質(zhì)和酶固態(tài)比在溶液中要穩(wěn)定的多。固態(tài)干粉制劑放在干燥劑中可長期保存。 ? ? ⑶ 在保護劑下保存 ： ? ①惰性的生化或有機物質(zhì)：如糖類、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩(wěn)定的疏水環(huán)境。 ? ②中性鹽：有一些蛋白質(zhì)要求在高離子強度（ 1 mol/L～ 4mol/L或飽和的鹽溶液）的極性環(huán)境中才能保持活性。常用 MgSO NaCl、 (NH4)SO4等。使用時要脫鹽。 ? ③巰基試劑：一些蛋白質(zhì)和酶的表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時可加入半胱氨酸或巰基乙醇。 ? 參見《生物化學(xué)制備技術(shù)》中“一些酶保存的條件和穩(wěn)定性”表。 ? 分離純化方法的選擇 ? 制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下： ? ①以 分子大小和形態(tài)的差異 為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。 ? ②以 溶解度的差異 為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 ? ③以 電荷差異 為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 ? ④以 生物學(xué)功能專一性 為依據(jù)的方法 ： 親和層析等。 ? ? ⑴早期分離純化 ? 1)特點： ? ①粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。 ? ②欲制備的生物大分子濃度很稀。 ? ③物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。 ? ④希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。 ? 2)對所選方法的要求： ? ①要快速、粗放。 ? ②能較大地縮小體積。 ? ③分辨力不必太高。 ? ④負荷能力要大。 ? ?3)可選用的方法： ? 吸附； ? 萃??； ? 沉淀法（熱變性、鹽析、有機溶劑沉淀等）； ? 離子交換（批量吸附、胖柱交換）； ? 親和層析等。 ? ⑵晚期分離純化 ? 1)可選用的方法： ? 吸附層析、 ? 鹽析、 ? 凝膠過濾、 ? 離子交換層析、 ? 親和層析、 ? 等電聚焦制備電泳、 ? 制備 HPLC等。 ? 2)要注意的一些問題： ? ①鹽析后要及時脫鹽。 ? ②用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因為凝膠層析柱的上樣體積只能是柱床體積的 1/10～ 1/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。 ? ③必要時也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如：分級有機溶劑沉淀、 ? 分級鹽析、 ? 連續(xù)兩次凝膠過濾、 ? 離子交換層析等。 ? ? ④分離純化步驟前后要有科學(xué)的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。 ? 例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因為離子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。 ? ⑤分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進行。 ? ⑥得到最終產(chǎn)品后，必要時要立即冰凍干燥，分裝并寫明標(biāo)簽，－ 20℃ 或－ 70℃ 保存。 ? ? ? ? ? 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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