真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的類型與常用真核細(xì)胞表達(dá)載體-資料下載頁
2025-08-05 10:44本頁面
【正文】 的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。用途: pEGFPActin載體在真核細(xì)胞表達(dá)EGFPActin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動蛋白，因而在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)含肌動蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。pSV2表達(dá)載體特點(diǎn)：該表達(dá)質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動子驅(qū)動在真核細(xì)胞目的基因進(jìn)行表達(dá)的，克隆位點(diǎn)為Hind111。SV40啟動子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來篩選、建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。CMV4 表達(dá)載體特點(diǎn):該真核細(xì)胞表達(dá)載體由CMV啟動子驅(qū)動，多克隆區(qū)域酶切位點(diǎn)選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長基因片段以及SV40復(fù)制原點(diǎn)和fl單鏈復(fù)制原點(diǎn)。但值得注意的是，該表達(dá)載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。其他常用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug說明:pBluescript II kS、pUC18 amp。 Puc19載體適合于DNA片段的克隆、DNA測序和對外源基因進(jìn)行表達(dá)等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源DNA片段扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細(xì)胞，并在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，含有外源DNA載體的細(xì)胞將為白色菌落，而無外源DNA片段載體的細(xì)胞則為蘭色菌落，由此易于篩選有無外源DNA片段的載體。此外，這些載體中有便于測序的M1T7和T3的通用引物進(jìn)行DNA測序。保存液: TE BufferTE Buffer組成:10mM (Ph )1mM EDTA用途:克隆外源DNA片斷.進(jìn)行基因表達(dá).使用M1T7和T3引物進(jìn)行測序.存在的問題細(xì)胞的生命活動是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，有些生命活動的機(jī)理還不完全清晰，由于插人的目的基因不同，載體構(gòu)建栗用的順式組件不同，組裝的空間位置不同，采用的表達(dá)系統(tǒng)不同，目的基因表達(dá)水平和陽性克隆篩選率都會有很大差異。另外，由于所有的順式元件存在種屬和組織特異性，所構(gòu)建的高效表達(dá)載體不一定在所有細(xì)胞株中均高效表達(dá)。再者，細(xì)胞生長狀態(tài)的差異，轉(zhuǎn)染方法的不同培養(yǎng)時閹的長短，篩選藥物濃度的高低，對表達(dá)量都有很大影響。所以，需要綜合評價一個表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)，排除一些不定因素，篩選出最佳組合真核表達(dá)載體趨向于既有利于擴(kuò)增目的基因又有利于篩選陽性克隆的載體的構(gòu)建。許多有效的應(yīng)用范圍廣的強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子被人發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于載體中，大大提高了目的基因的表達(dá)量，另外一些強(qiáng)的組成型啟動子，如 SV40早期啟動子+PHTLv，已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞系中。應(yīng)用以GS為篩選標(biāo)志的表達(dá)載體可兼有篩選和擴(kuò)增目的基因兩種功能，是目前研究的重點(diǎn)。以IRES連接的雙順反子表達(dá)載體已成為核表達(dá)載體的主體。在同一啟動子操縱下，篩選基因或報告基因與目的基因轉(zhuǎn)錄在同一mRNA上通過 IRES的作用，表達(dá)出兩種蛋白，因而在理論上可認(rèn)為，通過了篩選或表達(dá)了報告基因的克隆必為陽性克隆，即表達(dá)目的基因的克隆，有報道說這種雙順反子的共表達(dá)率為90%。這就大大提高了篩選率，簡化了實(shí)驗(yàn)過程。將強(qiáng)啟動子、增強(qiáng)子和可擴(kuò)增的篩選標(biāo)志組裝在同一載體上，構(gòu)建高效表達(dá)和篩選的表達(dá)載體并將其運(yùn)用于最合適的表達(dá)系統(tǒng)中，是當(dāng)今真核表達(dá)載體構(gòu)建研究發(fā)展方向。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞常見表達(dá)載體為：pCMVpNEOBAN載體、pEGFP,增強(qiáng)型絳色熒光蛋白表達(dá)載體、pEGFTActin 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達(dá)載體、pSV2表達(dá)載體、CMV4 表達(dá)載體。
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