【正文】 鹽、PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對酶無毒性、分離設備與化學工業(yè)通用等優(yōu)點，在工業(yè)上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無機鹽種類等因素影響，發(fā)展：具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術。 雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質純化 一些與水混合多聚物的不相溶性導致依賴于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的液液分配技術，可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種鹽，用于從微生物勻漿中除支細胞碎片、后續(xù)分配步驟進一步純化。分離的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。14．表面活性14．1泡沫分離 蛋白質溶液具有表面活性，氣體在溶液中鼓泡，氣泡與液相主體分離，在塔頂富集，達到分離和濃縮的目的。14．2反膠團相轉移法 反膠團相轉移法是80年代興起的一種新型分離技術，它利用表面活性劑分子在有機溶劑中自發(fā)形成的反向膠團（反膠團），在一定條件下將水溶性蛋白質分子增溶進反膠團的極性核（水池）中，再創(chuàng)造條件將蛋白質抽提至另一水相，實現(xiàn)蛋白質的相轉移，達到分離和提純蛋白質的目的。反膠團中的蛋白質分子受到周圍水分子和表面活性劑極性頭的保護，仍保持一定的活性，甚至表現(xiàn)出超活性。由于蛋白質增溶于反膠團與蛋白質所帶電荷及反膠團內表面電荷間的靜電作用及反膠團的大小有關，因而表面活性劑的種類、水溶液的pH值及離子強度等因素均影響反膠團對蛋白質的相轉移。據(jù)報道利用AOT／異辛烷反膠團對酵母脂肪酶進行相轉移。14．3聚合物鹽水液固苯取體系是90年代在國內開發(fā)的種新的萃取體系，成功地用于萃取金屬離子及卞果酸脫氫酶等生物活性物質較強的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接傾出液相即可使液固的相分離，勿需特殊技術處理，不用有機溶劑，無毒性，成相聚合物及鹽對生物活性物質有穩(wěn)定和保護作用，萃取分離選擇性好消耗低、易于規(guī)模放大的分離生隊物活件物質的新技術在聚乙二醇修飾物的聚乙二醇／葡聚糖雙水相萃取體系共價作用：主要用于含巰基酶的純化，通過共價鍵結合在層析介質上，偶聯(lián)是可逆的，能還原二硫鍵的低分子化合物洗脫，如空間位阻，可在含變性劑的緩沖液時吸附，如已含二硫鍵，則先用還原劑打開。重組蛋白和多肽的分離純化（4）網(wǎng)絡 選擇親和標簽時需要考慮的因素1. 親和標簽是否會影響到目標蛋白的結構和功能親和標簽與目標蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對目標蛋白結構功能的影響，又要考慮到對標簽與其配體親和作用的影響，以及實際的用途。大多數(shù)情況首選短的多肽標簽，這是因為短的肽標簽對目標蛋白的結構影響最小，在某些應用中，短肽不必要去除，因為重組蛋白已經(jīng)具有完全的生物學功能，這也是6 個組氨酸標簽比GST標簽應用更廣的原因，而且短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接的用于抗體的制備；而大的親和標簽可能限制重組蛋白的折疊，影響蛋白質的生物學功能。從另一方面來講目標蛋白可能會干擾短肽標簽與其配體的結合，與小的短肽標簽相比，大的多肽和蛋白質標簽也在實驗室作為常規(guī)選擇，它們的親和配體大多是低分子化合物，可以降低目標蛋白對結合的影響，增強純化的特異性（111），許多情況下，重組融合蛋白去除親和標簽后，目標蛋白可形成正確的結構。2. 蛋白質的穩(wěn)定性含有多對二硫鍵的蛋白質或某些蛋白在進行非融合表達時，常容易形成包涵體，或有降解發(fā)生。降解的原因有兩種情況，一是目標蛋白的不正確折疊，那么加入親和標簽如果能夠促進目標蛋白的正確折疊將有助于防止蛋白質的降解，第二種情況是末端氨基酸不穩(wěn)定，這時的原則是，N端融合有助于保護目標蛋白的N端，而C 端融合有助于保護目標蛋白的C 端，從而可以獲得全長的目標蛋白。親和標簽對蛋白質包涵體的形成可以促進，也可以減少，不同的標簽有不同的特性，多數(shù)情況還與表達系統(tǒng)相關。如麥芽糖結合蛋白（MBP）具有分子伴侶樣的特性，進行N端融合，常有助于蛋白質的正確折疊和活性蛋白的獲得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶體結構的研究（95）。3. 親和標簽所融合的位置親和標簽可以加在N端，可以加在C端，也進行串聯(lián)，如圖5 所示，在選擇融合位置的時候，要考慮所處位置對標簽親和性的影響，如GST適合加在N端，還要考慮融合可能對目標蛋白的影響，如果目標蛋白的Ｃ端序列包埋在蛋白的內部，那么進行Ｃ端融合就不合適。多數(shù)情況下蛋白質的N端區(qū)域對蛋白質的功能不是太重要，所以在N端進行融合標簽的融合常常能保留蛋白質的生物學功能。由于N端DNA序列對蛋白質的轉錄翻譯影響較大，所以標簽加在N端對蛋白質的表達水平影響更大，優(yōu)化標簽的mRNA結構可使表達水平提高。N端標簽對表達蛋白的溶解性影響更大，如在N端使用天然HAT標簽比6His標簽有助于目標蛋白的可溶性表達，而N端進行MBP融合表達也常用來提高目標蛋白的溶解性。進行分泌表達時，常選用可分泌的親和標簽，有些親和標簽不適合于放在N端，如6His標簽放在N端會影響重組蛋白信號肽的處理和目標蛋白的分泌，這是因為6His標簽具有多個帶電咪唑殘基。在選擇融合位置時，另一個方面的考慮是，C端融合在去除融合標簽后在目標蛋白的C端會有幾個氨基酸殘留，而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標簽后得到天然的目標蛋白。圖 5 進行載體構建時親和標簽相對目標蛋白所處的位置。4. 是否需要在變性條件下進行親和純化如果融合蛋白以包涵體的形式存在，由于大多數(shù)的親和標簽不適于在變性劑存在條件下進行親和純化，只能先進行包涵體的溶解和復性，再在非變性條件下進行親和純化，其中有些親和標簽可以促進蛋白的折疊復性，如來源于蛋白A的ZZ標簽，可使胰島素樣生長因子Ⅰ（IGFⅠ）融合蛋白在比非融合蛋白高100倍的濃度下成功折疊復性，并且不會形成沉淀（98），在選擇親和表達純化系統(tǒng)時需要考慮。組氨酸標簽在非變性和變性條件下通常均可進行親和純化，除了前面的這種方法可以使用，大多數(shù)情況下直接在變性條件下進行親和純化或親和層析復性，而且親和層析復性常?？梢蕴岣哒郫B的效率。5. 親和標簽對表達水平的影響親和標簽對表達水平的影響不僅與親和標簽和目標蛋白相關，還與可用的表達純化系統(tǒng)密切相關，需根據(jù)具體情況進行分析。6. 是否需要標簽具有鑒定功能首先要看針對目標蛋白是否有方便有效的分析鑒定方法，如果沒有可選擇能夠進行重組蛋白檢測的親和標簽。7. 親和洗脫的條件表4 列出了親和洗脫的條件，有些條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達系統(tǒng)應該不使目標蛋白變性。8. 親和介質和緩沖液的費用9. 是否在親和純化后去除標簽融合蛋白是否需要去除標簽，由目標蛋白的用途和標簽的特點來確定，如果用于免疫動物生產(chǎn)抗體，則不需要，如果不影響蛋白的功能研究，也不需要，如果影響了蛋白的功能研究或用于臨床治療，則需要去除標簽。表 4 常用的親和融合表達/純化系統(tǒng)親和標簽分子大小結合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)26 kDa(.)谷胱甘肽N 端還原型谷胱甘肽載體:pGEX, pET41, pET42, 可進行表達蛋白的檢測,融合蛋白形成二聚體金葡菌蛋白A(Protein A) IgG結合結構域30 kDahIgGN 端低pH載體:pRIT2T, 具有Protein A信號序列可進行分泌表達,可在弱變性條件下純化（）ZZ 結構域14 kDahIgGN 端低pH載體:pEZZ18, 具有Protein A信號序列可進行分泌表達,可使目標蛋白獲得正確的折疊鏈球菌蛋白G(Protein G)28 kDa白蛋白(HSA)N 端或C端低pH具有Protein G信號序列可進行分泌表達白蛋白結合結構域(ABD)525 kDa白蛋白(HSA)C 端低pH幾丁質結合結構域52 .幾丁質N 端或C端誘導剪切pTYB,pTWIN纖維素結合結構域(CBD)107,114,156 .纖維素N 端或C端乙二醇載體:pET 34, pET 35, pET 36, pET 37, pET 38,可增強表達蛋白的熱穩(wěn)定性,具有信號肽序列可進行分泌表達麥芽糖結合蛋白(MBP)41 kDa(.)直鏈淀粉N 端或C端麥芽糖載體:pMAL, 具有MBP信號序列可進行分泌表達,可改善溶解性PinPoint(可生物素化蛋白)13 kDa單體抗生物素蛋白N 端生物素載體:PinPoint, 可進行表達蛋白的檢測Biotin Avitag (可生物素化的短肽).單體抗生物素蛋白N 端或C端生物素載體:pAN, pAC, 可進行表達蛋白的檢測,可進行目標蛋白的固定化,可在變性條件下純化Strep tag Ⅱ(非生物素化親和)8 .鏈霉抗生物素蛋白變體StrepTactinN 端或C端脫硫生物素載體:pPRIBA, pASKIBA,具有OmpA信號序列可進行分泌表達, 可進行表達蛋白的檢測, 可進行目標蛋白的固定化,可在變性條件下純化鈣調蛋白結合肽(CBP)26 .鈣調蛋白N 端或C 端EGTA/EGTA和1M NaClpCAL組氨酸標簽(Poly His)6,8,10,18 .螯和金屬離子Ni2+或Co2+N 端或C 端咪唑/低pH載體: pET, pHAT, pQE,pProEx,pTrcHis,可在變性條件下純化表位標簽FLAG8 .單抗M1/M2使用M1單抗進行N 端融合,使用M2單抗N端或C 端融合融合蛋白與M1單抗的結合是鈣依賴的,使用EDTA, M2單抗是非鈣依賴的, 使用低pH或合成的FLAG肽載體。pFLAG,p3FLAG,已具有腸激酶酶切位點S 標簽15 .RNase A的S片段N 端或C 端低pH載體:pET,可進行表達水平的監(jiān)測T7 標簽11 .單抗N 端低pH載體:pET,可增強表達水平,可在弱變性條件下純化精氨酸標簽(Poly Arg)515 .強酸性陽離子基團C 端氯化鈉梯度苯丙氨酸標簽(Poly Phe)11 .疏水苯基N 端乙二醇HistagproteinpurificationusingNiNTA magnetic有吸引力beads珠狀物佚名 Histag protein purification using NiNTA magnetic beadsMaterials and reagents試劑Extraction buffer20 mM TrisHCl, pH 1 mM PMSF1 mg/ml lysozyme% Triton X100Magnetic 吸附PBS10 mM potassium phosphate, pH 250 mM NaCl% Triton X100Washing buffer10 mM KP, pH 300 mM NaCl20 mM imidazole8% glycerol% Triton X100MaterialsNiNTA magnetic beads (Qiagen) microfuge tubessample mixer equiped with tubeholding wheel (Dynal)magnetic rack (Dynal MPCS)Ultrasonic water bath (Branson 200)Preparation of the magnetic beads1.Pipette吸液管 30 ml of the magnetic suspension重懸 from the bottle and apply it to a microfuge tube.2.Place the tube in the magnetic rack架子, apply the magnet and remove the 3.Wash the beads with 300 ml magnetic PBS.4.Resuspend the beads in 50 ml extraction buffer.Procedure1.Apply ml of bacterial culture培養(yǎng)物 to a microfuge tube and spin 旋轉for 5 min at 13,000 rpm. Store the pellet菌 at –20176。C2.Add 300 ml of extraction buffer to the pellet, resuspend重懸浮 the cells and incubate保溫 the suspension for 30 min at room temperature.3.Homogenize使均勻 by sonicating the cell suspension for 3 min in the ultrasonic water bath.4.Take 10 ml of the homogenate and store for SDSPAGE analysis. Centrifuge離心分離 the rest for 10 min at 13,000 rpm.5.Remove the supernatant and discard the pellet. Take a 10ml sample of the supernatant f