【正文】 g/L，Rif 50mg/L），28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)與酶切鑒定。用檢測(cè)為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取大腸桿菌質(zhì)粒做酶切鑒定。鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子加入等體積50%的甘油，70℃冰箱長(zhǎng)期保存。 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代取水稻成熟種子去殼后，用75%的酒精浸泡兩次，每次1 min，再用25％的次氯酸鈉溶液浸泡30 min后于超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水沖洗三到五次，放在滅菌的濾紙上晾干，將消毒后的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿約20粒，于28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)1015 d。愈傷長(zhǎng)大后繼代23次，選擇適當(dāng)?shù)呐咝杂鷤M織用于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化整個(gè)操作過(guò)程包括愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的處理與轉(zhuǎn)化，洗菌及抗性愈傷組織的篩選四個(gè)方面。（1）愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取自然分散，結(jié)構(gòu)致密，顏色鮮黃且直徑約為23mm的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱28℃暗培養(yǎng)35d。（2）農(nóng)桿菌的處理與轉(zhuǎn)化從保存的鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子凍存管中挑取少量菌液于YEB固體培養(yǎng)基（Kan 50 mg/L，Rif 50 mg/L）劃線，然后在28℃暗培養(yǎng)兩天后，將農(nóng)桿菌放置4℃冰箱中保存，待用時(shí)提前兩天在固體YEB培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)。農(nóng)桿菌在固體YEB培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)2d后，用510ml AAM培養(yǎng)基（100181。mol/L AS）將農(nóng)桿菌洗脫，懸浮于100ml AAM培養(yǎng)基（100181。mol/L AS）中，劇烈搖動(dòng)調(diào)整菌液濃度至OD600nm = ，以便農(nóng)桿菌形成懸浮液，28℃靜置1 h。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)至滅菌的50 ml培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌懸浮液，輕微搖動(dòng)后，靜置30 min，倒掉菌液，然后將愈傷于無(wú)菌濾紙上晾干并轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基中，28℃中暗培養(yǎng)3 d。（3）洗脫農(nóng)桿菌暗培養(yǎng)3 d后，挑取經(jīng)共培養(yǎng)的愈傷組織于滅菌的50ml廣口培養(yǎng)瓶中，用滅菌的蒸餾水沖洗，每次搖動(dòng)數(shù)次，直至水中不見(jiàn)絲狀菌體，最后一次沖洗用含100 mg/L Ti的無(wú)菌水靜置1h，然后倒掉水，將愈傷組織置于無(wú)菌濾紙上在操作臺(tái)中吹干，然后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基一上進(jìn)行篩選。（4）抗性愈傷組織的篩選每?jī)芍軐⒂鷤D(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，約需三周即可見(jiàn)抗性愈傷組織從褐化干癟的愈傷組織中長(zhǎng)出。將抗性愈傷轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基二中，10 d左右觀察抗性愈傷組織的色澤，顏色鮮黃，結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織保留，并轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，顏色暗淡的愈傷則淘汰掉。 轉(zhuǎn)基因植株再生抗性愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基2周后，抗性愈傷開(kāi)始出現(xiàn)綠點(diǎn)，3周后可長(zhǎng)出幼芽，并伴隨根也長(zhǎng)出。待幼苗長(zhǎng)至23 cm時(shí)轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，每試管中1個(gè)克隆。幼苗長(zhǎng)至10 cm左右且根系生長(zhǎng)旺盛時(shí)開(kāi)始煉苗，710d后，移出試管，洗凈根上的培養(yǎng)基，然后移至大田栽種。 結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法愈傷組織誘導(dǎo)率 =（產(chǎn)生愈傷組織的種胚數(shù)/培養(yǎng)種胚數(shù)）100%愈傷組織褐化率 =（褐化的愈傷組織數(shù)/培養(yǎng)的愈傷組織數(shù)）100%抗性愈傷組織得率 =（抗性愈傷組織數(shù)/篩選培養(yǎng)基一上的愈傷組織數(shù)）100%愈傷組織分化率 =（分化的愈傷組織數(shù)/分化培養(yǎng)基上的愈傷組織總數(shù)）100%兩基因共轉(zhuǎn)化率 =（共轉(zhuǎn)化植株數(shù)/獲得的抗性植株數(shù)）100% 水稻葉片DNA提取 采用SDS方法提取水稻葉片DNA，具體過(guò)程如下：（1） ml離心管中，加入液氮，研磨成粉末狀；（2）加入650 μl預(yù)熱(65℃)的DNA提取緩沖液，混勻，然后放入65℃水浴鍋中溫浴2030 min；（3）取出離心管，冷卻后加入150 μl冰醋酸鉀（5 mol/L），混勻，放在冰塊上冰浴2030 min；（4）取出離心管，加入600 μl氯仿：異戊醇（24:1），輕微混勻，12000 r/m離心5 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一離心管中；（5）加入冰無(wú)水乙醇1000 μl，輕微混勻，靜置2小時(shí)左右，12000 r/m離心5 min，倒掉上清液；（6）加入70%的乙醇清洗兩次，再加入無(wú)水乙醇清洗一次；（7）倒掉上清液，室溫下吹干DNA；（8）加入500 μl ddH2O溶解DNA，待用。 水稻轉(zhuǎn)基因再生植株潮霉素抗性檢測(cè)分別取轉(zhuǎn)基因植株單株的35 cm的葉片，然后對(duì)應(yīng)放入標(biāo)記的試管中，加入5 ml濃度為40 mg/L潮霉素檢測(cè)溶液，同時(shí)取未轉(zhuǎn)基因葉片作對(duì)照，每天觀察葉片情況，7 d后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)（一）目的基因PCR擴(kuò)增的引物：（1）Cry30Fa1引物：F11：5’ATCCAATCTC CACAAAAACC3’F12：5’GTCCAGGCGA ATGAATACCC3’(PCR產(chǎn)物=649bp)F21：5’CGGAGATGAC TGGGCAAAGGC3’F22：5’CTGGCAGGGGAAGACAAGAAG3’ （PCR產(chǎn)物=957bp）（2）Cry54Aa1引物：A11：5’CCGAATCAACCATTACAAGA AC 3’A12：5’TCAGCATCGAGACTAGAAA ACC 3’（PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度=453bp）A21：5’CAAGGTCGTT AGAATCGCAG3’A22：5’TCATTTATGT TGAAGTGGGC3’ （PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度=674bp）（3）潮霉素抗性基因擴(kuò)增引物: Hpt F： 5’GGCGTAATAGCGAAGAGGC 3’Hpt R： 5’AATGTGTGAGTAGTTCCCAGA3’（PCR產(chǎn)物=568bp）（二）PCR反應(yīng)程序：（1）94℃ 5min。（2）94℃ 1min，56℃ 50s，72℃ l min，35個(gè)循環(huán)。（3）72℃ 10min。（三） PCR反應(yīng)體系：DNA模板 2 181。l （約3090 ng）10Buffer（含Mg2+25mmol/L） 2 181。l 1dNTP（） 2 181。l Taq酶 181。l引物（ mmol/L） 2 181。l加ddH2O 181。l至20 181。l反應(yīng)體積。（四）電泳檢測(cè)：用3%瓊脂糖凝膠電泳，電壓3V/cm，電泳l h，成像記錄電泳結(jié)果。 新型Bt基因含選擇標(biāo)記農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建與鑒定 含新型Bt基因中間載體pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1的構(gòu)建與鑒定新型Bt基因（Cry30Fa1和Cry54Aa1）為本實(shí)驗(yàn)室利用從海螺溝采集的Bt菌BtMc28分離克隆[83]，并按水稻基因喜好密碼子改造獲得。Cry30Fa1及 Cry54Aa1基因序列見(jiàn)附錄五。在新型Bt基因序列的兩端分別增加酶切位點(diǎn)序列，送基因合成公司合成兩端分別含BamHI與SacI酶切位點(diǎn)的目的基因片段。將目的基因片段與中間克隆載體pUPROK分別用BamHI酶與SacI酶進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)入中間克隆載體pUPROK，獲得含目的基因的pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1中間載體。對(duì)載體pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1進(jìn)行目的序列測(cè)序，結(jié)果表明正確構(gòu)建了含目的基因的pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1載體。 載體pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1的載體構(gòu)建過(guò)程 Construction of vectors pUPROKCry30Fa1 and pUPROKCry54Aa1 含新型Bt基因雙元載體pCDMARCry30Fa1Hyg與pCDMARCry54Aa1Hyg的構(gòu)建與鑒定（1）將通過(guò)鑒定正確的pUPROKCry30Fa1與pUPROKCry54Aa1載體，用HindIII和EcoR V酶切并用Klenow補(bǔ)平后連入SmaI酶切后的pCDMARHyg載體以獲得最終高效表達(dá)雙元載體。 載體pCDMARCry30Fa1Hyg與pCDMARCry54Aa1Hyg的構(gòu)建過(guò)程 B Construction of vectors pCDMARCry30Fa1Hyg and pCDMARCry54Aa1Hyg(2) 對(duì)質(zhì)粒pCDMARCry30Fa1Hyg與pCDMARCry54Aa1Hyg進(jìn)行酶切鑒定及目的序列測(cè)序，結(jié)果表明正確構(gòu)建了含目的基因的pCDMARCry30Fa1Hyg與pCDMARCry54Aa1Hyg載體。 A、B分別顯示了質(zhì)粒pCDMARCry30Fa1Hyg與pCDMARCry54Aa1Hyg的酶切鑒定情況。 質(zhì)粒pCDMARCry30Fa1Hyg，用EcoRI酶切可以得到大小分別為1431bp，2961bp，4392bp，11593bp，13204bp，14554bp的六條帶（ A第二泳道）；XhoI酶切可以得到大小為1094bp，3764bp，12221bp的條帶（ A第三泳道）；HindⅢ酶切可以得到大小為972bp，5574bp，10411bp的條帶（ A第四泳道）；BamHI與SacI酶切可以得到大小為4400bp，11585bp的條帶（ A第五泳道）；SphI酶切可以得到大小為4401bp，11584bp的條帶（ A第六泳道）。結(jié)果表明，pCDMARCry30Fa1Hyg載體的實(shí)際酶切片段數(shù)量及大小與預(yù)測(cè)的酶切片段的數(shù)量和大小一致，且經(jīng)過(guò)測(cè)序與原基因序列一致，表明獲得了正確序列的載體。質(zhì)粒pCDMARCry54Aa1Hyg的酶切鑒定與序列測(cè)序也得到相同結(jié)果（ B）。 A pCDMARCry30Fa1Hyg載體酶切鑒定圖譜Fig A Digestion map of pCDMARCry30Fa1HygM. λEcoT14Ⅰdigest DNA Marker (19329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925 bp)。1. pCDMAR30Fa1/EcoRI 2. pCDMAR30Fa1/XhoI 3. pCDMAR30Fa1/HindIII4. pCDMAR30Fa1/BamHI+SacI 5. pCDMAR30Fa1/SphI B pCDMARCry54Aa1Hyg載體酶切鑒定圖譜Fig B Digestion map of pCDMARCry54Aa1HygM. λEcoT14Ⅰdigest DNA Marker(19329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925 bp)1. pCDMAR54Aa1/EcoRI 2. pCDMAR54Aa1/XhoI 3. pCDMAR54Aa1/HindIII4. pCDMAR54Aa1/BamHI+SacI 5. pCDMAR54Aa1/SphI 秈性水稻成熟胚愈傷組織的獲得 將成熟水稻種子去殼后，用75%的酒精浸泡兩次，每次1 min，再轉(zhuǎn)入25％的次氯酸鈉溶液中浸泡滅菌20 min30 min，于超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水沖洗三到五次，將消毒過(guò)的種子在無(wú)菌濾紙上晾干，然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿約20粒，于培養(yǎng)箱中28℃暗培養(yǎng)1015d后，會(huì)長(zhǎng)出2 mm左右的愈傷組織（ A）。經(jīng)繼代23次后形成淡黃色致密的胚性愈傷組織可用于農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化（ B）。對(duì)恢復(fù)系R125與R818進(jìn)行了成熟胚的誘導(dǎo)與繼代，結(jié)果表明，R125與R818的種子基本上都能誘導(dǎo)出愈傷組織。 抗壞血酸對(duì)秈性水稻成熟胚愈傷組織獲得的影響研究對(duì)R125與R818誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行繼代，發(fā)現(xiàn)R125愈傷繼代后生長(zhǎng)情況較好，但是R818的愈傷組織在繼代過(guò)程中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重而無(wú)法獲得胚性愈傷組織。根據(jù)前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，在繼代培養(yǎng)基中加入適量抗壞血酸(Vc)可以減輕這種現(xiàn)象[84]。我們通過(guò)將誘導(dǎo)得到的愈傷組織分成4組，每組15盤(pán)愈傷，設(shè)置Vc濃度梯度為0，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vc的濃度為40mg/L時(shí)，能夠有效地降低愈傷組織的褐化，而且愈傷組織的再生能力較好 ()。 Vc對(duì)R818愈傷組織繼代與分化的影響Table The effection of Vc to subculture and regeneration of R818Vc濃度(mg/L)愈傷組織總數(shù)褐化愈傷組織數(shù)未褐化愈傷組織數(shù)分化愈傷組織數(shù)愈傷組織褐化率愈傷組織分化率0 2521945819%%20 2571837427%%30 2591758433%%40 2621639948%%50 2481549432%% 繼代次數(shù)對(duì)秈性水稻成熟胚愈傷組織獲得的影響對(duì)R125與R818誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行繼代，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的繼代次數(shù)對(duì)愈傷組織的再生能力也有很大的影響，我們通過(guò)對(duì)R12R818的愈傷組織在附加40 mg/L的繼代培養(yǎng)基中分別繼代2次，3次，4次后，并對(duì)其分化能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)R12%，%，%，表明R12R818愈傷組織繼代23次后獲得的愈傷組織的再生能力最強(qiáng)。 繼代次數(shù)對(duì)愈傷組織獲得的影響Table The effection of subculture times to callus試驗(yàn)材料繼代次數(shù)愈傷組織總數(shù)分化的愈傷組織數(shù)目分化率R1252280160%3186108%429283%R8182270140%318492%425868% 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)新型Bt基