20xx年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題—sirna導(dǎo)入細(xì)胞的策略(編輯修改稿)
2024-11-19 04:46 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 herin的表達(dá) ,破壞胚層的生長(zhǎng)發(fā)育 ,表型類(lèi)似于Ecadherin基因敲除小鼠基因。美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家在最新一期英國(guó)?自然醫(yī)學(xué)?雜志上報(bào)道，他們首次使活體動(dòng)物的基因沉默，治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。這次試驗(yàn)的做法是：在實(shí)驗(yàn)鼠尾部的血管注入靶定Fas基因的siRNA，發(fā)現(xiàn)有90%的肝細(xì)胞接受到了這種RNA分子。Fas蛋白質(zhì)的產(chǎn)量變?yōu)樵瓉?lái)的十分之一?！睳ature Medicine 2003。〕對(duì)于人來(lái)說(shuō)，身體比老鼠大的多，血液循環(huán)系統(tǒng)也龐大?？茖W(xué)家正在尋找把siRNA送到人體特定部位的方法，以便驗(yàn)證RNAi在人體中的效果。siRNA導(dǎo)入低等動(dòng)物個(gè)體的策略dsRNA首先應(yīng)用于非脊椎動(dòng)物中的線(xiàn)蟲(chóng),dsRNS導(dǎo)入線(xiàn)蟲(chóng)有兩種途徑 :⑴微注射dsRNS 。⑵線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)食含ｄｓＲＮＡ的Ｅ .ｃｏｌｉ也可產(chǎn)生弱效應(yīng) ,且效應(yīng)是可逆的。 微量注射在研究線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、渦蟲(chóng)的ＲＮＡｉ時(shí) ,普遍采用了雙鏈ＲＮＡ微量注射方法。ｄｓＲＮＡ的注射方式有三種 :⑴直接注射ｄｓＲＮＡ(注射前退火形成穩(wěn)定的雙鏈 )。⑵在低鹽濃度下把有義及反義ＲＮＡ混合后注射 。⑶把有義及反義ＲＮＡ分開(kāi)注射 ,但間隔必須盡量短 。如果兩者注射間隔時(shí)間超過(guò) 1小時(shí) ,那么基因干預(yù)能力將迅速下降。 低等動(dòng)物的喂食Fraser等與Gnczy等人在研究RNAi上取得了可喜的成績(jī) ,他們利用RNAi特異性這一優(yōu)點(diǎn) ,合成了上千個(gè)與開(kāi)放讀框相對(duì)應(yīng)的雙鏈ＲＮＡ和表達(dá)這些雙鏈ＲＮＡ的細(xì)菌克隆 ,分別用微量注射和喂食的方法導(dǎo)入線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi) ,干擾同源基因的表達(dá) ,再運(yùn)用子代分析和定時(shí)差異干擾比擬 (differential interference contrast, DIC)顯微分析法 ,成功地在基因組水平上大規(guī)模地篩選了功能基因 (稱(chēng)為ＲＮＡｉ篩選 ) ,證實(shí)了線(xiàn)蟲(chóng)染色體Ⅰ和染色體Ⅲ中早期胚胎細(xì)胞分裂及細(xì)胞代謝等有關(guān)的所有基因功能 (Ｇ ｎｃｚｙ ,2 0 0 0 。Ｆｒａｓｅｒ,2 0 0 0 )。其中,Ｆｒａｓｅｒ等在研究中設(shè)計(jì)了可表達(dá)ｄｓＲＮＡ的細(xì)菌文庫(kù),由于文庫(kù)中的細(xì)菌克隆可以復(fù)制,因此,用喂食進(jìn)行的ＲＮＡｉ篩選具有低本錢(qián)、高效、高重復(fù)使用性的優(yōu)點(diǎn) 電穿孔轉(zhuǎn)染惡性瘧原蟲(chóng) dhodh和 aro C基因用常規(guī)PCR從惡性瘧原蟲(chóng)基因組 DNA中擴(kuò)增而來(lái)。將 ds RNA參加到同期瘧原蟲(chóng)中 ,對(duì)環(huán)狀滋養(yǎng)體用 5%山梨糖醇培養(yǎng) 42 44h,對(duì)晚期滋養(yǎng)體需再培養(yǎng) 2 4h,然后用 2 0 0 Ω,2 5μF和 6. 2 5Kv Cm1 的電流進(jìn)行電穿孔。用RPMI aro培養(yǎng)基稀釋并分裝至 96格的培養(yǎng)皿中 ,每個(gè)樣本一式三份 ,每 2 4h更換一次培養(yǎng)基。瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)可通過(guò)測(cè)量放射性示蹤物質(zhì)次黃嘌呤的結(jié)合進(jìn)行監(jiān)測(cè) 體內(nèi)表達(dá)siRNA 利用熱誘導(dǎo)控制表達(dá)形成ｄｓＲＮＡ干擾基因表達(dá) ,可以控制ＲＮＡｉ在特定時(shí)期表達(dá) ,拓展了ＲＮＡ干擾的應(yīng)用空間 .利用熱誘導(dǎo)可以使整個(gè)生物體產(chǎn)生全局性的干擾 ,而不至于產(chǎn)生傳統(tǒng)ＲＮＡ微注射干擾帶來(lái)的鑲嵌現(xiàn)象[5 ]目前采用的解決方法主要是利用Ｐ因子載體 ,以更準(zhǔn)確地了解這類(lèi)基因功能 ,在其上游構(gòu)建熱啟動(dòng)子和構(gòu)建內(nèi)源的可穩(wěn)定遺傳的ＩＲ基因(ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ),將該載體轉(zhuǎn)入果蠅的品系中 ,在需要時(shí)熱誘導(dǎo)ＩＲ基因表達(dá) ,形成發(fā)
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