ch7-gangan-基因工程(編輯修改稿)
2025-02-07 14:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 內(nèi)擴(kuò)增。n 轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction) :n 指以 噬菌體 為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移 DNA的過程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過 逆轉(zhuǎn)錄病毒 轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞 DNA的過程。生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞n 重組體導(dǎo)入大腸桿菌n 氯化鈣法n 電穿孔法 (electroporation)n 病毒感染法 /體外包裝法生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世氯化鈣轉(zhuǎn)化法n 附著 ：在 Eppendorf管中加入 100 μl感受態(tài)細(xì)胞和 10μl 40ng DNA溶液， 溫和混勻，于冰上 50min。n 熱激 ：于 42℃ 水浴 90S。n 冷激 ：冰浴 2min。n 復(fù)蘇 ：加 500μl LB液體培養(yǎng)基 37℃ x 50minn 涂皿 ：取適量菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的瓊脂糖平皿， 37℃ 培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世電穿孔法生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世電穿孔法生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世DNA Movement電穿孔法生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世電轉(zhuǎn)儀生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞n 重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞n 脂質(zhì)體介導(dǎo)法：人工細(xì)胞膜（ 培養(yǎng)細(xì)胞 ）n 病毒感染法（ 腺病毒 ） n 顯微注射法（ 轉(zhuǎn)基因 ）n 磷酸鈣共沉淀法厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝三、 DNA重組體的篩選與鑒定生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世DNA重組體的篩選與鑒定n 根據(jù)重組 載體 的表型進(jìn)行篩選n 普通抗菌素平板篩選 : (Amp+、 Kan+、 Cl+）n 報(bào)告基因：（熒光蛋白等）n 插入失活篩選 ：n α互補(bǔ) —— 藍(lán) 白斑篩選 ： 含 LacZ基因（編碼 β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物 Xgal(5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 )產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源 DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來篩選重組細(xì)菌，稱之為藍(lán) 白斑篩選生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世 藍(lán)白篩選n IPTG：誘導(dǎo) LacZ及 LacZ’(F因子上 )表達(dá)n Xgal： (5 溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 ) n β半乳糖苷酶底物水解顯色生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世DNA重組體的篩選與鑒定n DNA限制酶切圖譜分析 bp— 1534— 994— 695— 515— 377— 237 A B C M 生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世DNA重組體的篩選與鑒定n PCR鑒定（菌落 PCR）n 利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定 厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝基因工程的工具酶生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世基因工程常用的工具酶工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割 DNA 連接酶 催化 539。磷酸與 339。羥基形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以 DNA為模板合成 DNA RNA聚合酶 (逆轉(zhuǎn)錄酶 ) 以 RNA為模板合成 DNA 堿性磷酸酶 切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶 催化核酸 539。羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化 339。端合成同聚體尾生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世限制性核酸內(nèi)切酶n 概念：是由細(xì)菌產(chǎn)生的一種能 識(shí)別雙鏈DNA中的 特定序列 ，并以內(nèi)切方式水解核酸鏈中磷酸二酯鍵的 核酸內(nèi)切酶 ，又叫切割酶或限制酶。n 分類： Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型。以 Ⅱ 型為主。n 命名原則：生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世常用限制性內(nèi)切酶的種類n 目前發(fā)現(xiàn) 2300多種 REn 230多種限制性位點(diǎn)生生 物物 化化 學(xué)學(xué) 第九章第九章 糖代謝糖代謝厚德厚德 博學(xué)博學(xué) 精誠精誠 濟(jì)世濟(jì)世： 5‘GAATTC3’ 5’G AATTC3’3‘CTTAAG5’ 3’CTTAA G5’ EcoRⅠ +5‘粘性末端：識(shí)別和切割位點(diǎn)平端或鈍端3‘粘性末端PstISmaI生生 物物 化
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