[工程科技]色譜分離技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-15 13:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 型色譜條件快速、可靠地放大 （ 4） SMB色譜裝置可以適合不同規(guī)模的色譜分離過程 因此， SMB色譜有可能成為化學工業(yè)及精細化工的一個新 的操作單元，隨著系統(tǒng)設計方法及固定相的不斷開發(fā)研 究， SMB色譜技術(shù)的應用將日益廣泛 ? SMB色譜技術(shù)的優(yōu)勢 30 （二）、擴展床吸附色譜 （ EBA） EBA色譜是適應基因工程、單克隆細胞工程等生物工程的下游純化工作需要而發(fā)展起來的一項色譜技術(shù) ? EBA色譜的基本原理和特點 EBA色譜的工作原理與一般的吸附色譜相同，但工作過程不同，其示意圖如下： 31 如上圖所示， EBA工作過程為： ? 凝膠顆粒在向上的流體作用下向上擴展 ? 當向上的液體流速與凝膠顆粒的沉降速度達到平衡時，凝膠顆粒處于平衡懸浮狀態(tài)，這時形成穩(wěn)態(tài)流動柱床，柱塞的位置處于柱床的頂部 ? 接著將經(jīng)離心、澄清過濾等處理的樣品液以上向注入柱床，目標蛋白質(zhì)吸附在凝膠顆粒上，而有形顆粒直接穿 過柱床 ? 柱床隨著液相上向流動而得到?jīng)_洗，未被吸附的物質(zhì)都 流出床層，這時停止上向流動液體，凝膠顆粒沉降下來，柱塞也逐漸下降至沉降床層表面 ? 然后以洗脫液下向流動進行洗脫，得到目標蛋白質(zhì)的濃縮液，以便進行進一步純化工作 ? 洗脫完成后，用適當?shù)木彌_液對柱床進行再生 。 32 EBA色譜具有如下特點： ? EBA色譜過程中，有形生物體可通過床層。因此可將生物工程下游純化技術(shù)中的離心、澄清過濾等多步驟提取過程簡化為簡單的一步色譜分離過程，大大簡化了工藝，縮短了提取時間，節(jié)約了生物工程中下游純化的資金投入 ? EBA色譜是兼具批量吸附技術(shù)和填裝吸附色譜（ Packed Bed Adsorption， PBA） 優(yōu)點的實用技術(shù)，具有對原材料依賴性低，吸附效率高的特點。因此， EBA色譜可在短時間內(nèi)對目標生物分子起到濃縮作用，且分離過程中凝膠無損失，可重復使用，易于控制，易于規(guī)?；?。 33 ? EBA色譜常用固定相（凝膠）及選擇原則 ? Streamline系列凝膠（ Amersham Pharmacia Biotech公司設計生產(chǎn) ） ? Cetamic Hypet D系列凝膠（法國 Biosepra公司生產(chǎn) ） ? Fractosil系列 （德國 Merck公司生產(chǎn)，以多孔硅膠為基質(zhì) ） ? Bioran系列 （德國 Schott Glaswerke公司生產(chǎn)，以多孔玻璃為基質(zhì) ） ? DMI凝膠 （以纖維素 鈦混合為基質(zhì) ） ? Macrosorb K4AX凝膠 （以硅藻土 瓊脂糖混合物為基質(zhì)的） 常用 EBA凝膠 34 EBA色譜的凝膠選擇原則 ? 凝膠介質(zhì)的顆粒大小和密度能使原材料的生物體和吸附劑顆粒間的臨界沉積流速產(chǎn)生明顯的區(qū)別 ? 凝膠介質(zhì)的顆粒大小和密度分布應使 EBA擴展過程盡量小的固液軸向混合 ? 吸附劑應能耐受培養(yǎng)基中生物體、核酸、脂類物質(zhì)等的污染 ? 連接到吸附劑上的配基應足夠穩(wěn)定 ? 吸附劑的物質(zhì)轉(zhuǎn)移能力在 EBA色譜應用中足夠有效 35 ? EBA色譜柱床的特征 床層擴展的影響因素 床層擴展平衡后所達到的高度受到吸附劑顆粒大小和密度，流動相線性速度及流動相粘度的影響，如流速的影響： 右圖所示為使用Streamline凝膠和未修飾的瓊脂糖吸附劑時，在不同流動相流速下床層的相對擴展程度 36 床層擴展的絕對高度隨著操作溫度和緩沖液體系（液體 密度和粘度）的改變而改變 如下圖所示，床層擴展后的高度隨著緩沖液體系的不同而改變，同時隨著緩沖液流速增加而增高。因此，在 EBA色譜應用于粘度很大的原料液時，密度和粘度對床層的影響是一個重要因素 37 EBA與填充吸附色譜柱床 （ PBA） 的吸附特征非常相似 下圖所示為以 Streamline DEAE為吸附劑，在擴展床和填充床兩種情況下，柱床對 BSA的穿透容量 擴展床的吸附特性 由圖中可見，在兩種情況下，穿透容量及穿透曲線的斜率僅有微小差別。這就表明了在 PBA和 EBA模式中，吸附劑的吸附性能是極其相同的。 38 擴展床操作壓力 通常填充床的床層空隙率為 ，而擴展床的床層空隙率則很高，約為 所以在整個操作過程中，擴展床的操作壓力都相當?shù)?，通常低?（ 50kPa） 39 物理參數(shù) ? 影響 EBA色譜的參數(shù) 化學參數(shù) 影響 EBA色譜的主要因素可大致分為兩方面： 與操作條件有關(guān)的，如：操作溫度、液體流速及沉降床層高度等 與液體培養(yǎng)基的組成相關(guān)的，如 細胞密度、生物體含量和液體粘 度等 是指影響分離過程選擇性、負載容量的因素。主要包括 pH值、離子強度、凝膠的特性、緩沖溶液種類等 40 ? EBA色譜的應用 從 6磷酸脫氫酶 （ G6PDH） EBA色譜系統(tǒng)： 色譜柱為 Streamline 50， 內(nèi)徑 50mm，裝 填吸附劑 Streamline DEAE（與 Procion Red HETB偶 合） 420ml，相應的沉降床層高度為 21cm 原料液： 粘度為 ，生物體干重為 %（ w/w） 。 上樣量： 以 G6
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