生物分離工程第八章電泳技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-12 11:54 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 質(zhì)等電聚焦電泳 1000~2022V，固相梯度等電聚焦3000~8000V ? 外循環(huán)恒溫系統(tǒng) :高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻； ? 凝膠干燥器 :用于電泳和染色后的干燥； ? 灌膠模具 ：制膠，玻璃板和梳子； ? 電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如 PVDF膜 ? 電泳洗脫儀：回收樣品 ? 凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進行掃描，從而給出定量的結(jié)果。 垂直電泳槽及灌膠模具 電泳的一般過程 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理： ? 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級， 能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應 。 ? 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離時，在電泳過程中 不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。 ? PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳 電泳前的準備工作 ?緩沖系統(tǒng)的選擇： –保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； –電泳時間和分辨率：從理論上講 PAGE可以在任何 pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此， pH應限制在 3~10之間。 緩沖系統(tǒng)的選擇原則 ?是兩種標準的對立權(quán)衡 – 如果緩沖液的 pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄； – 如果緩沖 pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇 pH ~，常用的緩沖液有 Tris甘氨酸（ pH ~）， Tris硼酸 (pH ~)和Tris醋酸（ pH ~） 離子強度的選擇 ?離子強度不宜過高，此時電導率低，產(chǎn)熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質(zhì)絮凝。 ?一般選擇緩沖液的離子強度為 ~ mol/L之間 凝膠濃度的選擇 ? 由于 PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關。 ? 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： – 非排阻性凝膠（ unrestrictive gel） :濃度 ~%的瓊脂糖凝膠； – 排阻性凝膠（ restrictive gel） ：濃度大于 1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī) PAGE ? 凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置； ? 凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離； 凝膠濃度 (C=%) 分子量范圍 (kDa) 凝膠濃度 (C=5%) 分子量范圍 (kDa) 5 30~200 5 60~700
黨政相關相關推薦
鄂ICP備17016276號-1