【正文】 始致力于微生物酶法合成LDOPA的研究。其主要步驟是：待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈模板；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3’端開始摻入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA 新股。 瓊脂糖凝膠電泳原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。(1+E)2=…=X（2）滅菌：將平板2塊與裝有培養(yǎng)基的錐形瓶分別包扎， mL的離心管置于密封容器中，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。（7）小心取出上清液，用預(yù)冷的二倍體積的無水乙醇沉淀DNA，室溫放置10min以上，12000r/min離心10min,棄上清液。按下列程序依次加入試劑，按50μl反應(yīng)體積配制PCR反應(yīng)體系(注意：水先加，然后依次加入其他試劑，模板DNA最后加) PCR方法(1)[注意：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)立對照。（6）預(yù)混和分裝PCR試劑:PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝。在讀期間，得到了常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥系候老師、彭老師 等老師和同學(xué)的無私幫助和大力支持，在此一并表示深切的感謝!最后，感謝曾經(jīng)給予我鼓勵、支持和幫助的朋友們、同學(xué)們!參考文獻(xiàn)[1] 韋平和，彭加平，營佳. 酪氨酸酚裂解酶及其在L酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用[J].中國生化藥物雜志，2012,33（5）:695697.[2] 李華鐘, 孫 偉, 劉吉泉, 陳 堅(jiān). 弗氏檸檬酸細(xì)菌酪氨酸酚解酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)[J].工業(yè)微生物,2001,31(3):912.[3] 李偉平，王樹英，嚴(yán) 群，李華鐘. 構(gòu)建高表達(dá)酪氨酸酚裂解酶重組大腸桿菌合成左旋多巴[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005,36(12):743746.[4] 劉志國，[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.[5] 趙亞力，馬學(xué)斌 ，韓為東 聚合酶鏈反應(yīng) 《分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)》 2006年1月第1版 9196頁。電子天平都要預(yù)熱30min后才可以進(jìn)行使用。（樣品進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓降不高于5V/cm(電壓值V與電泳板兩極之間距離比)。（3）裂解：向每管加入200uL裂解緩沖液（40mmol/L TrisHCl ，20mmol/L乙酸鈉，1mmol/L EDTA,1%SDS），用槍頭反復(fù)吹打以懸浮和裂解細(xì)菌細(xì)胞。（3）酶及其他材料溶菌酶、RNA水解酶、蛋白酶K、Taq酶、dNTP、引物、DNA marker 等，均由常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。如果兩個(gè)引物Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm 低5℃。②引物堿基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。EDTA也具有降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，并抑制DNase活性的作用。PCR技術(shù)能夠快速特異地?cái)U(kuò)增任何目的基因或DNA片段，并很容易使得微微克（pg）水平的起始物達(dá)到毫微克（ng）水平的量。綜合國內(nèi)外研究狀況，目前，LDOPA 主要通過從植物中提取、化學(xué)法合成以及微生物酶法轉(zhuǎn)化等方法生產(chǎn)獲得。 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畢業(yè)設(shè)計(jì)報(bào)告（論文） 系 別： 制藥與生物工程技術(shù)系 課題名稱： 弗氏檸檬酸桿菌TPL基因的體外擴(kuò)增 指導(dǎo)教師： 班 級： 生物制藥1021 學(xué)生姓名： 1摘 要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過變性、退火和延伸的循環(huán)來完成核酸分子的大量擴(kuò)增。上世紀(jì)70年代初，國外化學(xué)法合成LDOPA的年產(chǎn)量已達(dá)150噸，但由化學(xué)法所合成出來的產(chǎn)物是D型和L型的混合物，而DDOPA會引起人體毒性反應(yīng)[5]，因此應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床之前必須通過控制旋光度的方法來減少DDOPA的影響。它不僅可以用于基因分離、克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制探查、法醫(yī)鑒定等諸多方面。TrisHCl（）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。（1）設(shè)備潔凈工作臺（SWCJIF）上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（2）儀器電子天平1（FA1104）上海良平儀器有限公司電子天平2（MP5002）上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司恒溫氣浴搖床（HZ8811K）常州市博宏高科試驗(yàn)設(shè)備有限公司手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（）上海申安醫(yī)療器械廠隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP9080MBE）上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH4）國華電器有限公司基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（DTC）西安天隆科技有限公司電泳儀（DYY4C）北京市六一儀器廠多功能水平電泳槽（6H12003282）北京市六一儀器廠漩渦混合器（QT1）上海琪特分析儀器有限公司熱磁力攪拌器（SH3）臺式高速離心機(jī)（RJTGL—16B）無錫市瑞江分析儀器有限公司冰箱（BCD155TDGA）青島海爾股份有限公司可見紫外檢測