【正文】 全酶 (holoenzyme) ?? ? ? ? ? ?? ? ? ? 原核的 RNA聚合酶 核心酶與 σ亞基 ? 原核 RNA聚合酶的 σ亞基能識別啟動子 ? σ亞基 在轉(zhuǎn)錄開始后 脫離核心酶 ? 核心酶 完成后續(xù)的轉(zhuǎn)錄過程 35區(qū) 10區(qū) 圖 113 原核生物的 RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 （ DNA雙鏈已打開， σ因子尚未脫落） 啟動子 (promoter) ? 啟動子 :RNA聚合酶結(jié)合模板 DNA的部位 5?3? 3?5? 結(jié)構(gòu)基因 調(diào)控序列 RNApol 原核 RNA聚合酶的 σ亞基能識別啟動子 RNA聚合酶保護法 一種巧妙的研究啟動子序列的方法 4060bp的 DNA片段沒有被降解，暗示 ——DNA與RNA聚合酶結(jié)合的部位 原核生物啟動子保守序列 開始轉(zhuǎn)錄 (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py 10 區(qū) T T G A C A A A C T G T 35 區(qū) RNApol辨認位點 (recognition site) 5? 5? 結(jié)構(gòu)基因 3? 3? RNA聚合酶保護區(qū) 1 30 50 10 10 40 20 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? 轉(zhuǎn)錄的過程 ? 轉(zhuǎn)錄起始 ? RNA的延長 ? 轉(zhuǎn)錄終止 原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的聚合酶、起始、終止都有所不同 原核生物轉(zhuǎn)錄的過程 ? 轉(zhuǎn)錄起始 需解決兩個問題： 1. RNA聚合酶必須準確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。了解真核生物的轉(zhuǎn)錄過程，是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要基礎(chǔ)。 自我剪接 二、 mRNA的剪接（去除內(nèi)含子） ? hnRNA 和 snRNA ? 外顯子 (exon)和內(nèi)含子 (intron) ? 內(nèi)含子的分類 ? mRNA的剪接 ? 除去 hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接 二、 mRNA的剪接（去除內(nèi)含子） snRNP與 hnRNA結(jié)合成為剪接體 ① snRNP與 hnRNA結(jié)合成為剪接體 （續(xù)） ② ③ UACUACA AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1 U2 U U U5 UACUACA AG UG U6 E1 E2 U2 剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應 (twice transesterification) pGOH (ppGOH, pppGOH) UOH GpU pGpA 第一次轉(zhuǎn)酯反應 第二次轉(zhuǎn)酯反應 UpA GpU 外顯子 1 內(nèi)含子 外顯子 2 GOH UpU pGpA 三、 mRNA的編輯 (mRNA editing) ? RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工 (differential RNA processing)。 乳糖操縱子的調(diào)節(jié)機制 ? 沒有乳糖的時候，該基因是不需要表達的，即該基因的表達是被抑制的。 轉(zhuǎn)錄活化染色質(zhì)與非活化染色質(zhì)在結(jié)構(gòu)上有很大不同 。 典型的 啟動子核心序列 （ core sequences） 是在轉(zhuǎn)錄起始位點上游 25~35 bp處 ， 有一保守的 TATA序列 ， 被稱為TATA 盒 （ TATA box ） ， 真核細胞的 TATA 盒 多 為TATAAAA序列 。 通過結(jié)合它的調(diào)節(jié)序列直接 、 或間接活化或阻遏特異基因的轉(zhuǎn)錄 。 ② 基因阻遏蛋白與基因活化蛋白分別與 DNA調(diào)節(jié)序列結(jié)合 ， 但阻遏蛋白通過與活性蛋白的基因活化區(qū)域相互作用 ， 使后者不能發(fā)揮活化作用； 真核細胞阻遏蛋白有更多可能的作用機制： ① 結(jié)合沉默子或與基因活化蛋白競爭同一 DNA調(diào)節(jié)序列； ⑤ 吸引組蛋白脫乙酰化酶 。 引導 RNA可能作為編輯過程的模板 ， 并將其 3?端的 U轉(zhuǎn)移給被編輯的 mRNAs。 ? 簡述真核生物 mRNA轉(zhuǎn)錄后加工修飾。 三、 RNA編輯可以改變 RNA分子信息的內(nèi)涵 某些 mRNAs在翻譯前被編輯 (editing)。 此外 ， 多數(shù)全酶復合體中缺少一些通用轉(zhuǎn)錄因子 ， 如 TFIID與 TFIIA， 它們需要在啟動子處分別組裝 ， 最后形成穩(wěn)定的 轉(zhuǎn)錄起始復合物 （ transcription initiation plex） ， 啟動轉(zhuǎn)錄 。 二、反式作用因子：轉(zhuǎn)錄因子 基因調(diào)節(jié)蛋白（ gene regulatory proteins） 反式作用因子（ transacting factors） 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 (transcription regulation factors) 轉(zhuǎn)錄因子是由不同的功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的調(diào)節(jié)蛋白 ? 上游因子（ upstreamfactors）： 與上游調(diào)控元件結(jié)合的蛋白質(zhì) ? 可誘導因子（ inducible factors）： 在某些特殊生理情況下才被誘導產(chǎn)生的，可與調(diào)控元件結(jié)合的蛋白質(zhì) 2. 真核基因的調(diào)節(jié)蛋白 還有蛋白質(zhì)因子可特異識別 、 結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列 ， 調(diào)節(jié)自身基因的表達 ，稱 順式作用 。 ? 但更多的基因調(diào)控區(qū)域結(jié)構(gòu)復雜 ? 順式作用元件 (cisacting element) ? 與基因表達調(diào)控有關(guān)的 DNA序列 ? 分子內(nèi)作用元件 ? 反式作用因子 (transacting factor) ? 與基因表達調(diào)控有關(guān)的 蛋白質(zhì) ? 分子間作用因子 ?對 順式作用元件 反式作用因子 相互作用的各種信號進行解讀 ， 并整合所獲信息來決定鄰近基因的開與關(guān) 。單一啟動子可以被分散在 DNA分子上 、 數(shù)量近乎無限的調(diào)節(jié)序列所控制 。 2? 操縱序列 —— 阻遏蛋白 (repressor)的結(jié)合位點 當操縱序列結(jié)合有 阻遏蛋白 時 ， 會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合 ， 或是 RNA聚合酶不能沿 DNA向前移動 ， 阻礙轉(zhuǎn)錄 。 3? hnRNA 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾 真核生物轉(zhuǎn)錄后修飾 （ posttranscriptional modification） ? 幾種主要的修飾方式 1. 剪接 (splicing) 2. 剪切 (cleavage) 3. 修飾 (modification) 4. 添加 (addition) 一、 mRNA的 首、尾的修飾 ? 5?端形成 帽子結(jié)構(gòu) (m7GpppGp — ) ? 生成甲基化的三磷酸雙鳥苷 ? 在核內(nèi)完成 ? hnRNA剛剛合成 2530 nt時，就形成了“帽子”結(jié)構(gòu) ? 起始蛋白質(zhì)翻譯的必須 ? 避免被 RNA核酸酶降解 ? 3?端加上 多聚腺苷酸尾巴 (poly A tail) ? 維持 mRNA作為模板的活性 ? 增加 mRNA本身的穩(wěn)定性 主要功能 帽子結(jié)構(gòu) 甲基化的三磷酸雙鳥苷 帽子結(jié)構(gòu)的生成 ? 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 hnRNA第一個核苷酸往往是 5’三磷酸鳥苷 pppG 5? pppGp… 5? GpppGp… pppG ppi 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 5? m7GpppGp… 甲基轉(zhuǎn)移酶 SAM 5? ppGp… 磷酸酶 Pi ? 磷酸酶水解 ? 與另一個 pppG反應，生成 三磷酸雙鳥苷 ? 甲基化，第一或第二鳥嘌呤堿基發(fā)生甲基化 ? 帽子結(jié)構(gòu)完成 二、 mRNA的剪接（去除內(nèi)含子） 核內(nèi)的蛋白質(zhì) 小分子核糖核蛋白體 snRNP （ small nuclear ribonucleoprotein） snRNA RNA剪接的場所 ? hnRNA 和 snRNA ? hnRNA (heteronuclear RNA)： 核內(nèi)的初級轉(zhuǎn)錄物（成熟的 RNA剪接前的“前體”） ? snRNA (small nuclear RNA) ? hnRNA 和 snRNA ? 外顯子 (exon)和內(nèi)含子 (intron) ? 外顯子（編碼區(qū)） ? 在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟 RNA的核酸序列。 ? 類似 DNA復制的時候 原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸 原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象 5? 3? DNA 核糖體 RNA RNA聚合酶 電子顯微鏡照片 轉(zhuǎn)錄未完成，翻譯已經(jīng)在進行著 原核生物 轉(zhuǎn)錄終止 指 RNA聚合酶在 DNA模板上停頓下來不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復合物上脫落下來。C 肽 轉(zhuǎn)錄 翻譯 5′3′ mRNA N ? 依賴 Rho (ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止 ? 非依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止 分類： 依賴 Rho因子 的轉(zhuǎn)錄終止 A T P ρ因子： ? 1969年 Roberts在被 T4噬菌體感染的 E. coli 中發(fā)現(xiàn) ? 與 RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，改變 RNApol構(gòu)象，使其停頓 ? 有 ATP酶活性，解旋酶（ helicase）活性 非依賴 Rho因子 的轉(zhuǎn)錄終止 DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出 RNA后， RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。 ? 內(nèi)含子（非編碼區(qū)） ? 隔斷基因的線性表達，而在剪接過程中被除去的核酸序列。 啟動序列 編碼序列 操縱序列 pol 阻遏蛋白 3) 其他調(diào)節(jié)序列、調(diào)節(jié)蛋白 例如 激活蛋白 (activator)可結(jié)合啟動序列鄰近的 DNA序列 ， 促進 RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合 ， 增強 RNA聚合酶活性 。 真核細胞對基因表達起始的調(diào)控至少在下面幾個方面與原核細胞存在不同： * 真核細胞基因及其調(diào)控區(qū)域受到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的限制 ，轉(zhuǎn)錄的活化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域 、 轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的諸多變化相關(guān)； ? 真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控