realtimepcr詳解-(留存版)
【正文】 ? 避免同一堿基重復(fù)過多。同時確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 ? 每次實驗都設(shè)置陰性對照和標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品設(shè)兩個平行孔 。長度 30bp 引 物 設(shè) 計 原 則 ? 在探針確定以后再選擇引物 ? 引物要盡可能地接近探針，但是不要重疊 ? 保持 GC含量在 3080%之間 ? 避免同一堿基重復(fù)過多。 ?可以使用熱啟動辦法或使用特殊處理的 Taq酶 ?要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計 ?如果反應(yīng)體系中出現(xiàn) PCR的抑制因素 ， 應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增 。 如何設(shè)計熒光定量 PCR實驗方案 ? 根據(jù)儀器和個人的喜好，確定熒光定量 PCR的方法，選擇熒光素的種類 ? 合成引物和探針 ? 收集樣品、提取 RNA或 DNA（ 80℃ 保存，避免反復(fù)凍融 ） ? 制備標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)粒、化學(xué)合成的目的基因） ? 拷貝數(shù) =質(zhì)量 247。 ? 為了確保引物和探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在，如果發(fā)現(xiàn)由非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。定量 —— 絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線方法 ?標(biāo)
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