【正文】 血清的使用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（原因與結(jié)果難以對應(yīng)）。,,1,2,3,4,5,Conwey微擴(kuò)散(ku242。血管的培養(yǎng)方法很多。)，用Hanks液洗一次。n) 污染，腦垂體保持正常的生長素分泌能力。guān)培養(yǎng)方法,搖擺式器官培養(yǎng)法： 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法雖是動態(tài)培養(yǎng)，但操作復(fù)雜。,第九十八頁，共一百一十二頁。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基與氣象界面上培養(yǎng)， 植塊可同時獲取營養(yǎng)和充足的氧氣。表玻璃上加雞胚 質(zhì)和雞血漿→凝固→培養(yǎng)的器官移植其上→放入培養(yǎng) 皿內(nèi)→入箱培養(yǎng)。,胚胎與成體(ch233。,第八十八頁，共一百一十二頁。（3）多聚賴氨酸液。 成熟的骨骼肌細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂。,結(jié)果分析： 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)3~5天后開始形成集落、擴(kuò)展； 10天左右集落融合(r243。n) 角質(zhì)形成細(xì)胞的生長與分化；細(xì)胞接種密度抵、增殖 快、生長穩(wěn)定、傳代較好。 人們甚至正在嘗試：培育能充當(dāng)藥物釋放渠道 的組織。,第七十一頁，共一百一十二頁。 4.目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究比較欠缺。 細(xì)胞系或細(xì)胞珠不同，其無血清培養(yǎng)基需求不同， 在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段(jiēdu224。ng)：,滲透壓：高滲透壓提高細(xì)胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對數(shù) 生長期長短、細(xì)胞死亡速度。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度（以減少乳酸）同時平衡葡萄糖與Gln的比例。iyǎng)的應(yīng)用,酶類：組織血纖維溶酶原激活計（tPA）等； 激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素（EPO）、促黃體生成素 （LH）、促濾泡素（FSH）。 國外，氣升式反應(yīng)器已放大到5 000~10 000L，攪 拌式反應(yīng)器達(dá)到8 000L。,2.4.6.5 微多孔載體的制備(zh236。ili224。,第五十頁，共一百一十二頁。bāo)免受機(jī)械損傷； 11.接種方便； 12.能固定大部分細(xì)胞； 13.適合大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)； 14.細(xì)胞載體培養(yǎng)基易分離； 15.適于貼壁和懸浮培養(yǎng)；,第四十八頁，共一百一十二頁。 動物活體組織分散、過濾、離心、純化、漂 洗，接種到適宜培養(yǎng)液中，于特定培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。)和永 久保存；增加了培養(yǎng)面積?？蓪⑴囵B(yǎng)物 接種在載玻片上，再入旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，取載玻片觀察。,4.2.5 動物(d242。sh249。d242。也稱通用培養(yǎng)基（可用于 許多細(xì)胞）。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長因子及無 機(jī)物等，在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長。iyǎng)條件和工具,一、培養(yǎng)條件： 1. 溫度： 2. pH： 3. 氣體： 4. 營養(yǎng)： 二、培養(yǎng)工具(gōngj249。 衰亡期（senescence）：營養(yǎng)物的耗盡和有害 物質(zhì)的作用，細(xì)胞死亡數(shù)大于細(xì)胞分裂數(shù)。i),衰老(shuāilǎo),死亡,傳 代 期,細(xì) 胞 系,連續(xù)細(xì)胞系,原代 培養(yǎng),轉(zhuǎn)化,傳代間隔,細(xì) 胞 濃 度 的 指 數(shù),第二十頁，共一百一十二頁。)于（也能 代表）體內(nèi)組織、藥物測試的好對象。,4.1.5 體外培養(yǎng)細(xì)胞(x236。,影響(yǐngxiǎng)細(xì)胞形態(tài)的主要因素,細(xì)胞的來源不同； 生理條件不同，功能狀態(tài)不同； 血清成分、培養(yǎng)基成分、 添加成分、培養(yǎng)基的酸堿 度、氣象環(huán)境(hu225。,貼附型細(xì)胞(x236。iyǎng)細(xì)胞的分型,貼附和非貼附生長： 1.貼附型細(xì)胞(x236。 5.橋粒連接： 有間隙，有纖維形成的特殊結(jié)構(gòu)。sh249。u)和功能的技術(shù)，稱動物細(xì)胞與 組織培養(yǎng)。,4. 1.1 發(fā)展(fāzhǎn)歷史,近年： 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使動物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入了 一個新領(lǐng)域。 3.培養(yǎng)過程需氧量少，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感。,第九頁，共一百一十二頁。iyǎng)時如此。,非貼附型細(xì)胞(x236。 但細(xì)胞密度進(jìn)一步加大、營養(yǎng)減少、代謝產(chǎn)物增多 時，（因營養(yǎng)和代謝物的影響）細(xì)胞分裂停止，出 現(xiàn)接觸抑制。,第十八頁，共一百一十二頁。 細(xì)胞分裂指數(shù)（mitotic index, MI）: MI=(分裂相個數(shù)∕1000個細(xì)胞) 100% 。)的對數(shù),潛伏期,對數(shù)(du236。高溫對細(xì)胞的威脅更大。n)——天然培養(yǎng)基,血清提供細(xì)胞生存、生長和增殖必須的激素與生長 因子(yīnzǐ)：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素（雌二 醇、孕酮、睪酮）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、 表皮生長因子（EGF）、血小板生長因子（PDGF） （2） 鼠尾膠原及其他膠原：細(xì)胞附著、生長的 基質(zhì)，利于組織（特別是上皮類）細(xì)胞的固定。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基： （2）無血清培養(yǎng)基（serun free medium,SFM）： 化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確培養(yǎng)基（chemical defined medium)。iyǎng)與傳代培養(yǎng)(p233。 （2）塑料：聚苯乙烯。iyǎng)法,懸滴培養(yǎng)法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上， 加一滴培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片（植塊和培養(yǎng)液懸掛）放 置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。載玻片——上下 壁，金屬圈——側(cè)壁，密封成小 室，其側(cè)面有液體(y232。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常用 的體外培養(yǎng)技術(shù)(j236。,4.2.6.2 微載體(z224。nd224。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的小孔供細(xì)胞生長、增加細(xì)胞的固定化和穩(wěn)定 化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞。i)方法,材料不同、制備(zh236。,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。w249。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。bāo)代謝水平、對細(xì)胞(x236。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。 離線測定：需要時間長，來不及指導(dǎo)控制有關(guān)參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費(fèi)用。nzhu224。)反應(yīng)，失敗率極高；異體 器官來源有限，供不應(yīng)求，難以實(shí)施移植。ngp237。 hǎo)，燒傷的依情況定。u zǔ zhī)的體外培養(yǎng),4.3.2.2.1 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。（3）取原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞記數(shù)，接種在明 膠覆蓋的培養(yǎng)板上，進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)。,4.3.2.3 神經(jīng)(sh233。,第八十九頁，共一百一十二頁。,第九十一頁，共一百一十二頁。)受到抑制。iyǎng)方法,擦鏡紙培養(yǎng)法： 直接漂浮培養(yǎng)法的不足：器官易轉(zhuǎn)曲。ich237。guān)培養(yǎng)—灌流式器官培養(yǎng)法,培養(yǎng)系統(tǒng)的特征： 采用一個連有傾斜注射器外套的培養(yǎng)容器，新鮮 培養(yǎng)液從儲液罐通過注射器不斷流入培養(yǎng)容器，液體 由外套的出口端流出，其流速由恒流泵控制(k242。,4.4.5 器官培養(yǎng)(p233。,4.4.5.2 神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) 1985年，斯坦斯維格成功建立了大鼠胚胎腦組織的 培養(yǎng)——半固體瓊脂包埋靜止(j236。 3）放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。美 國密執(zhí)安大學(xué)開發(fā)生物工程人造腎?；钜蜃樱∕AN）、T細(xì)胞替代因子(TRF)等。如可導(dǎo) 電聚合物、膀胱、（人眼角膜細(xì)胞培育）人造角膜。 3）給Conway微擴(kuò)散單位裝置中央孔內(nèi)加滿培養(yǎng)液，消 毒濾紙蓋住中央孔。 3.培養(yǎng)盤或板先加0.5ml培養(yǎng)液，植入植塊，再加 1ml 培養(yǎng)液，加蓋，37度、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。,第一百零五頁，共一百一十二頁。,第一百零二頁，共一百一十二頁。d236。guān)培養(yǎng)方法,金屬格柵器官培養(yǎng)法： 漂浮支持物很難持久地漂浮。ngjiě)在培養(yǎng)液中，并防止植 快下沉而黏附。,第九十二頁，共一百一十二頁。)，一片皮膚等。,4.4 器官(q236。即體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。,第八十一頁，共一百一十二頁。 （2）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備(zh236。,4.3.2.1 上皮組織(sh224。o)制成的各鐘三維結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體（支架），在細(xì)胞增殖過程中，提 供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而 自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定 形態(tài)和功能的組織和器官。 5.相關(guān)基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。,4.2.8 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀(xi224。 在大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞死亡或凋亡 主要是：營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。葡萄糖濃度很高時，MG升 高。zǐ)：提高細(xì)胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑 制因素的積累。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),二、應(yīng)用：目前動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗（HbsAg）、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等； 非抗體(k224。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),一、生物反應(yīng)器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動物細(xì)胞的大量 培養(yǎng)。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。b232。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動物細(xì)胞生存的立 體三維空間（類似于毛細(xì)血管）。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子（帶適當(dāng)電荷）作微載體， 利于細(xì)胞的貼壁生長。iyǎng)技術(shù),在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化 細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器和人工灌 流等技術(shù)而發(fā)展(fāzhǎn)起了動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。iyǎng)瓶培養(yǎng)(p233。nzhuǎn)管培養(yǎng)法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法：1933~1934年Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。 繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞， 此時有細(xì)胞運(yùn)動，無細(xì)胞分裂。 4.2.3.2 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖(zēngzh237。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基（synthetic medium）：給細(xì)胞提供近 似體內(nèi)(tǐ n232。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,1. 天然培養(yǎng)基（natural medium）：來自動物體液 或組織分離提取的培養(yǎng)基。iyǎng)的特點(diǎn),動物細(xì)胞營養(yǎng)需求苛刻：氨基酸（細(xì)胞是不能自 主合成必須氨基酸的）、單糖（能源；合成某些氨基 酸、脂肪(zhīf225。持續(xù)3~5天。 細(xì)胞株（cell strain）：在經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系 中，通過單細(xì)胞培養(yǎng)或篩選法，由單細(xì)胞增殖形成的 細(xì)胞群。 獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化（遺傳性改變）生存期則發(fā)生 變化。,第十四頁，共一百一十二頁。,貼附型細(xì)胞(x236。從生長表面脫落而進(jìn)入液體 的細(xì)胞通常不再生長而逐漸退化。n),動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出 細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境條件， 在無菌、適宜溫度(wēnd249。 2.間隙連接： 23nm間隙。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的奠基人：美國生物學(xué)家哈里森 （1907年）用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將 蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活幾周，有細(xì) 胞突起(tūqǐ)的生長過程。,4. 1.1 發(fā)展(fāzhǎn)歷史,動物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)的起源： 19世紀(jì)所應(yīng)用的胚胎學(xué)技術(shù)。diǎn),（一）動物細(xì)胞之間的連接特點(diǎn)： 1.緊密連接：牢固、無間隙。ini224。ngxīn)布滿表面。,第十一頁，共一百一十二頁。 有些(yǒuxiē)細(xì)胞既可懸浮，也可以貼附。 如：人胚成纖維細(xì)胞存活一年、傳30~50代相當(dāng)于 150~300個細(xì)胞周期）；供體是成體或衰老個體時則 存活更短；肝、腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代。 細(xì)胞系（cell line）：第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞。)生 長期，群體細(xì)胞數(shù)增殖一倍所需要的時間，以時間T 表示） 積分得： T ＝ ㏑2 ∕μ (時間T表示細(xì)胞比生長 速率) 此時期細(xì)胞以指數(shù)形式增長繁殖。,4.2.1 體外