【正文】 上述程序 多用于動(dòng)物個(gè)體的轉(zhuǎn)基因過程 ，由于必須單細(xì)胞逐一操作，所以 不太適用于基因的克隆和表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外 D NA重組很困難，因此通常采用 體內(nèi)重組 的方式進(jìn)行。 20221022 121 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）腺病毒 DNA載體的特點(diǎn) ?基因重排低： 外源基因與病毒 DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期 ?安全性能好： 不整合人的染色體 DNA，不會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤 ?宿主范圍廣： 對(duì)受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格 ?使用效果好： 外源基因在載體上容易高效表達(dá) 20221022 122 目的基因在宿主中的表達(dá) 猴多瘤病毒 DNA（ SV40） （ 1） SV40的生物學(xué)特性 ?SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP VP VP3三種 衣殼蛋白 包裝而成，基因組為 5224bp的雙鏈環(huán)狀 DNA。 20221022 106 目的基因在宿主中的表達(dá) 20世紀(jì) 80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組 HBsAg， 主要工作包括將 S多肽的編碼置于 ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為 22 nm， 其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體 DNA上。 ?電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是 不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件，適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá) 105 / 181。 20221022 83 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中含有兩種不同 的雙鏈線狀質(zhì)粒 pGKL1和 pGKL2。 20221022 71 目的基因在宿主中的表達(dá) A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 20221022 72 目的基因在宿主中的表達(dá) 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 20221022 59 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）重組質(zhì)粒的逃逸率 當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中 一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為 稱為 重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率 。 其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段 N 端的第一位氨基酸殘基保持不變。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常 受體細(xì)菌的蛋白部分位于 N端，異源蛋白位于 C端。形成二硫鍵的方式主要有： 化學(xué)氧化法（ A）： 需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊。 事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體 法的長處所在。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè) tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。 ② 翻譯起始密碼子： 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起 始位點(diǎn)，但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子。 ?過長的 mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程 中往往添加 IAA誘導(dǎo) Ptrp介導(dǎo)的目 基因的表達(dá)。 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有 與啟動(dòng)子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的。 除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子。 分段稀釋法： 逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少 數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，其表達(dá)效率通常要比包涵體方式 低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌 盡管有，但并不普遍。 ?外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。 20221022 52 目的基因在宿主中的表達(dá) ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa1 Ile Glu Gly Arg Glu ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位點(diǎn) 20221022 53 目的基因在宿主中的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 構(gòu)建串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷 貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。 1987年， Novo公司推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。 UBA1缺陷型： UBA1編碼泛素激活酶 E1， UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。這樣，目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體 DNA區(qū)域。 20221022 96 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 釀酒酵母的半乳糖利用酶系由 GAL GAL7和 GAL10基因編碼。 20221022 103 目的基因在宿主中的表達(dá) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ，具有感染力的病毒顆粒呈球面 狀，直徑為 42 nm， 基因組僅為 kb。 不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因 hprt與之遺傳互補(bǔ)。 20221022 125 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 4）利用 SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序 20221022 126 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 5） SV40 DNA載體的特點(diǎn) ?基因表達(dá)好： 外源基因能高效表達(dá) ?基因重排高： 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象 ?宿主范圍窄： 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞 ?裝載量較小 20221022 127 目的基因在宿主中的表達(dá) 人乳多瘤病毒 DNA（ BKV） （ 1）人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性 人乳多瘤病毒（ BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈 DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá) 500個(gè)拷貝。 利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒 DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。 20221022 140 目的基因在宿主中的表達(dá) ?哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 ?利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體 ?利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑 ?利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子 VIII 20221022 141 目的基因在宿主中的表達(dá) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 （ 1）通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。 20221022 134 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 1）磷酸鈣共沉淀法 將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入 CaCl2溶液混勻，此時(shí) DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)； 將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 37℃ 保溫 416小時(shí)此時(shí) 細(xì)胞膜形成吞噬泡 ，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞； 棄去 DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。 ?pV2GPT： 是一種 SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒 DNA雜合的載體，其中 gpt為細(xì)菌來源的谷氨酸 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。 20221022 113 目的基因在宿主中的表達(dá) 高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件 高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件 ?細(xì)胞系特征： 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng) ?遺傳穩(wěn)定性： 外源基因多次傳代后不會(huì)丟失，易于長期保存 ?合適的標(biāo)記： 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持 ?生長快且齊： 分裂周期短，生長均一，便于控制 ?安全性能好： 不合成致病物質(zhì)，不致癌 大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，癌細(xì)胞能滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。 20221022 102 目的基因在宿主中的表達(dá) 重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有 200萬病人死亡，并有 3億人成為 HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。 20221022 93 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）顯性標(biāo)記基因 顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是毒性物質(zhì)的抗性蛋白 標(biāo)記基因 aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2 編碼產(chǎn)物 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 二氫葉酸還原酶 銅離子螯合物 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 乙酰乳糖合成酶 遺傳表型 抗 G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受銅離子 耐受高濃度蔗糖 抗硫酰脲除草劑 20221022 94 目的基因在宿主中的表達(dá) ?酵母菌啟動(dòng)子的可控性 ?外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素 ?酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇 20221022 95 目的基因在宿主中的表達(dá) 酵母菌啟動(dòng)子的可控性 （ 1）溫度控制型啟動(dòng)子 pho4TSPHO5啟動(dòng)子 ?釀酒酵母 PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開； ?PHO4基因編碼產(chǎn)物是 PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子； ?PHO4溫度敏感型突變基因 pho4TS的編碼產(chǎn)物在 35℃ 時(shí)失活。 20221022 86 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）含有酵母菌染色體 DNA同源序列的 YIp質(zhì)粒的構(gòu)建 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體 DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為 YIp。 能抑制超糖基化的突變類型 突變類型 生物效應(yīng) 甘露糖生物合成缺陷型 天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型 外側(cè)糖鏈添加缺陷型 20221022 80 目的基因在宿主中的表達(dá) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。 ?培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定； ?培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定。 純化后的融合蛋白用 Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列 的目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。如若將外源基因與大腸 桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其 N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去。 20221022 37 目的基因在宿主中的表達(dá) 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊；通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性。 20221022 31 目的基因在宿主中的表達(dá) ?包涵體型異源蛋白的表達(dá) ?分泌型異源蛋白的表達(dá) ?融合型異源蛋白的表達(dá) ?寡聚型異源蛋白的表達(dá) ?整合型異源蛋白的表達(dá) ?蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 20221022 32 目的基因在宿主中的表達(dá) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) （ 1）包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（ Inclusion Bodies， IB）。 20221022 23 目的基因在宿主中的表達(dá) ?起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG和 UUG 三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50% 而 UUG只及 AUG的 25%。 ?cAMP的正調(diào)控作用 20221022 16 目的基因在宿主中的表達(dá) (3)啟動(dòng)子的可控性： 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp的可控性 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底