【正文】 (二) 操作步驟1. 打開(kāi)激光破膜儀的控制軟件，解鎖激光。九、 玻璃化冷凍后的胚胎復(fù)蘇以下操作流程為卵裂期胚胎為例，卵子與囊胚的復(fù)蘇操作可參考此流程。1. 提前30分鐘打開(kāi)超凈工作臺(tái)。a：；b：；c：約2cm含胚胎的培養(yǎng)基；d：； f： 培養(yǎng)基（4） 在顯微鏡下檢查胚胎殘留情況，若無(wú)胚胎殘留，盡快通知臨床醫(yī)生，同時(shí)告知護(hù)士移植管黏液和血塊情況。 20％，大小比較均勻；3. Day3（授精后6468小時(shí)）：610細(xì)胞，碎片163。應(yīng)在相對(duì)固定的時(shí)間授精（取卵后36小時(shí)），相對(duì)固定的時(shí)間觀(guān)察原核（授精后1620小時(shí)），并記錄好這兩個(gè)時(shí)間。2. 卵細(xì)胞成熟度的判斷MII期卵子：細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)消失，第一極體已排出。退出注射針后，調(diào)節(jié)持卵針負(fù)壓，釋放卵子。7. 換稍細(xì)口徑吸管繼續(xù)吹打，以去除剩余的顆粒細(xì)胞層，再改換新的稍粗口徑吸管將卵子移入GMOPS Plus中洗滌，再轉(zhuǎn)移至已預(yù)平衡過(guò)的G1 Plus微滴皿中，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中備用。5. 把卵子轉(zhuǎn)移到剝卵皿液滴，先用微吸管吹吸受精卵23次，盡量除去顆粒細(xì)胞直至可清晰觀(guān)察受精卵。8. 撿卵結(jié)束后，粗略評(píng)估卵母細(xì)胞的質(zhì)量和成熟度，確定合適的授精時(shí)間，通常需培養(yǎng)36小時(shí)。2. 卵泡沖洗培養(yǎng)液（GMOPSTM）：取GMOPSTM10ml放入圓底試管（Falcon 2001）中，加入肝素300IU/100ml，緊蓋后置37℃培養(yǎng)箱中平衡過(guò)夜，備用。7. 精子數(shù)目≥1106，PR精子≥15%的附睪穿刺液，可以用微量梯度離心法進(jìn)行處理。常用劑量是每天4次，每次4片（1g/片）。1. 試劑和耗材準(zhǔn)備 QUEENS’精液冷凍保護(hù)劑復(fù)溫至室溫，精液冷凍支架，巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；2. 步驟（1） 患者按照精液樣本的采集方法留取精液后，置37℃培養(yǎng)箱中液化。%密度梯度離心液于45%密度梯度離心液底部，保持兩種液體的界面。準(zhǔn)備90%密度梯度離心液、45%密度梯度離心液各1ml，使用前配好并在1小時(shí)內(nèi)使用。（4） 待患者取好精液后，護(hù)士與患者丈夫當(dāng)面留取精斑樣本于基因卡上，并填好相關(guān)信息，患者丈夫按指模并在《接受助孕夫婦取精認(rèn)證書(shū)》簽名確認(rèn)后，護(hù)士把標(biāo)本、基因卡及《接受助孕夫婦取精認(rèn)證書(shū)》交給實(shí)驗(yàn)室人員。4. 液氮罐：應(yīng)始終備有狀態(tài)良好的備用液氮罐。接觸配子與胚胎的一次性耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)人精子存活試驗(yàn)，證明無(wú)毒方可使用。試劑分裝后在各分裝容器上做明顯標(biāo)志，標(biāo)明名稱(chēng)、有效期、分裝時(shí)間，并用封口膜密封容器口。4. 每日觀(guān)察并記錄胚胎實(shí)驗(yàn)室與冷凍間、緩沖間、移植手術(shù)室及取卵手術(shù)室之間的壓差。3. CO2進(jìn)入培養(yǎng)箱之前，必須經(jīng)過(guò)CODA過(guò)濾器對(duì)CO2進(jìn)行過(guò)濾。11. 所有操作步驟和體液處理應(yīng)小心，盡量減少浮滴和煙霧生成。1. 所有體液樣本（精液、血液、卵泡液等）必須視同潛在污染源，所有的供體組織和體液應(yīng)有適當(dāng)?shù)膫魅静”O(jiān)測(cè)。%；2. 溫度的控制：37℃177。2. 液氮運(yùn)輸罐需專(zhuān)人更換。(八) 熱臺(tái)的質(zhì)量控制專(zhuān)人管理，每天操作前檢測(cè)并予以記錄。（2） 使用前必須檢查有效期和包裝是否完好無(wú)損，不使用過(guò)期用品及包裝破損用品。實(shí)驗(yàn)室管理人員必須按實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保障體系執(zhí)行，明確實(shí)驗(yàn)室的各個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)格遵循質(zhì)量安全程序、標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法。(三) 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境按常規(guī)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，溫度由層流空調(diào)機(jī)組調(diào)控，發(fā)生故障立即報(bào)修；若空氣細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果超標(biāo)，立即清潔實(shí)驗(yàn)室，并重新進(jìn)行空氣培養(yǎng)。精液標(biāo)本不能暴露在過(guò)高或過(guò)低的溫度中，運(yùn)送途中樣本應(yīng)該保持在20℃~37℃的環(huán)境中。（3） 將已液化的精液輕輕加于梯度離心液之上，300g離心15分鐘。 直接離心洗滌法（1） 精液標(biāo)本充分液化。（6） 將冷凍支架投入液氮，凍存。6. 射精后，患者及時(shí)排尿于無(wú)菌的取精杯中，并將射出的精液和尿液同時(shí)送精液處理室。3. 實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生同時(shí)核對(duì)患者姓名及其妻子姓名，在附睪、睪丸取精/活檢手術(shù)記錄上簽名。(二) 撿卵1. 根據(jù)患者卵泡數(shù)目，在IVF工作站臺(tái)面上預(yù)熱一定數(shù)量Falcon 3003培養(yǎng)皿。通常用于授精的精子終濃度為1105/ml。 PESA/TESA獲得的精子； 常規(guī)IVF受精失?。ǔ墒炻炎邮芫实陀?0%）。安裝持卵針和注射針時(shí)，應(yīng)避免注射針管道系統(tǒng)中有氣泡。（4） 用注射針制動(dòng)精子要避開(kāi)其頸部。3. ICSI破膜方式A：破膜順利。（四） 囊胚的評(píng)分1. 分期1期：早期囊胚，囊胚腔不到整個(gè)胚胎的1/2。2. 選擇移植胚胎的原則（1） 移植胚胎的數(shù)量嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生部規(guī)定，35歲以下患者不超過(guò)2個(gè)，35歲及以上患者以及多次IVF失敗的患者可以一次移植3個(gè)胚胎。七、 囊胚培養(yǎng)1. 囊胚培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：受精后第2天準(zhǔn)備囊胚培養(yǎng)皿，使用G2 Plus在培養(yǎng)皿（Falcon300l）中制作10個(gè)微滴，每個(gè)微滴25ml，蓋礦物油3ml。5. 液氮準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一個(gè)小液氮容器，裝滿(mǎn)液氮，并準(zhǔn)備兩根長(zhǎng)鑷子。5. 用準(zhǔn)備好的巴氏德吸管將胚胎轉(zhuǎn)移至DS液中（室溫），停留3分鐘，在此期間將胚胎移動(dòng)1~3次。5. 對(duì)需要行輔助孵化的所有胚胎完成削薄操作。11. 完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室記錄。8. 將胚胎裝入冷凍載體上，插入液氮中時(shí)應(yīng)輕晃一下，這樣可以使胚胎加速降溫。6. D5檢查囊胚形成率并進(jìn)行評(píng)分，選擇可供移植或冷凍的胚胎。在D56，選擇囊腔擴(kuò)張充滿(mǎn)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)致密、細(xì)胞數(shù)多，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多的胚胎。2. 36期囊胚再評(píng)估項(xiàng)目?jī)?nèi)細(xì)胞團(tuán)：A：包裹緊密，大量細(xì)胞B：結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞C：極少量細(xì)胞滋養(yǎng)外胚層：A：許多細(xì)胞形成緊密結(jié)合的上皮B：少量細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)松散的上皮C：極少量細(xì)胞（五） 解凍胚胎的評(píng)分1. 解凍后所有卵裂球存活的胚胎，按新鮮胚胎的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分； 2. 解凍后如有卵裂球死亡，則僅記錄存活的卵裂球數(shù)，不再進(jìn)行評(píng)分；3. 凍融胚胎一半以上卵裂球存活，胚胎可判斷為存活，可用于移植。（二） 受精卵評(píng)分1. 正常受精卵（2PN）：表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)原核，可見(jiàn)第二極體。卵細(xì)胞外觀(guān)顏色較深，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘細(xì)胞排列變稀松，顏色變淺。12. 精子制動(dòng)：將注射針移入含有精子的條形PVP液滴中，在微滴上端選擇形態(tài)、活力正常的精子吸入注射針，轉(zhuǎn)入另一PVP微滴，將精子放置于操作皿底部。準(zhǔn)備一個(gè)四孔皿，其余三孔加入平衡好的GMOPS Plus各1ml，在37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘。卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus在Falcon 300l小皿中做10個(gè)液滴，中間兩滴用于清洗，每滴25ml，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過(guò)夜。將選出的卵子先置于撿卵皿中暫存。若精子數(shù)量能夠滿(mǎn)足臨床應(yīng)用，通知男科醫(yī)生結(jié)束手術(shù)。2. 術(shù)前，實(shí)驗(yàn)室為男醫(yī)科生準(zhǔn)備1管預(yù)平衡的GIVF Plus和24支5ml圓底試管。（5） 復(fù)蘇后的精液信息需在精液冷凍登記本中進(jìn)行標(biāo)記，包括復(fù)蘇時(shí)間，精子的活力，密度及用途。（7） 200g，離心5分鐘。 雙層梯度離心法+上游法（1） 雙層梯度離心法同前面的步驟（1）（5）。2. 精液外觀(guān)（1） 正常精液液化后呈均質(zhì)，灰白，精子密度非常低者可顯得透明。練習(xí)ICSI 精子制動(dòng)、吸打、定點(diǎn)停位，模擬卵子注射。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的主要設(shè)備，如顯微鏡、培養(yǎng)箱、冰箱等均連接UPS，保證電壓穩(wěn)定，并且在意外斷電情況下可提供6－8小時(shí)的電力供應(yīng)。作為對(duì)照管。4. 儀器設(shè)備一旦出現(xiàn)異?；虬l(fā)生故障，使用人員應(yīng)立即關(guān)機(jī)觀(guān)察，防止事故擴(kuò)大，及時(shí)向?qū)嶒?yàn)室負(fù)責(zé)人或中心負(fù)責(zé)人匯報(bào)，然后通知修理人員組織維修。(六) 實(shí)驗(yàn)室層流系統(tǒng)的質(zhì)量控制1. 體外受精實(shí)驗(yàn)室溫度維持在24177。培養(yǎng)箱內(nèi)壁以75%酒精和超純水分別擦拭。6. 離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，脫掉實(shí)驗(yàn)室衣服，不能穿著出入公開(kāi)場(chǎng)所或餐廳。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，將手套脫下丟掉，決不可重復(fù)使用。消毒時(shí)拆卸培養(yǎng)箱內(nèi)所有鋼架，以75%酒精和超純水分別擦拭消毒，再送高壓消毒。3. 超凈臺(tái)每年應(yīng)至少檢測(cè)一次潔凈度。3. 儀器設(shè)備的維修保養(yǎng)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定的程序進(jìn)行，有關(guān)人員在進(jìn)行保養(yǎng)、調(diào)校和維修工作以前，應(yīng)首先熟悉儀器的性能、結(jié)構(gòu)、使用方法和保養(yǎng)、調(diào)校方法，以及維修程序。(十一) 人精子存活試驗(yàn)使用上游法處理精液，獲得活動(dòng)良好的精子，調(diào)整精子濃度為5106/ml，在待測(cè)物品中放置一段時(shí)間（3－5分鐘），如吸管、移液管、針管等在精子混懸液中反復(fù)抽吸后，再放入5ml試管內(nèi)，作為實(shí)驗(yàn)管。試劑名稱(chēng)作用貨號(hào)Vitrolife G5系列GMOPSTMGMOPSTMPLUS非CO2依賴(lài)型培養(yǎng)液在室溫、大氣環(huán)境中處理、操作卵子和胚胎K021893GIVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G1TMPLUS卵裂胚培養(yǎng)液原核期、DD3胚胎培養(yǎng)K022244G2TMPLUS囊胚培養(yǎng)液囊胚培養(yǎng)K021890HYASETM，透明質(zhì)酸酶消化、移除卵丘細(xì)胞K000627ICSITM，PVP精子制動(dòng)K043116OVOILTM，培養(yǎng)用石蠟油避免液體揮發(fā)和污染K991351SpermRinseTM洗精液精子處理：洗精K