【正文】 擬南芥GNAT家族包括AtGCN5/HAGHAT1/HAG2以及AtELP3/ELO3/HAG3,其中AtGCN5研究的最充分，它在體外能乙?；疕3(Earley等, 2007)，并且Atg5突變體中整體水平上的H3乙酰化減少(Bertrand等, 2003)，特別是特定基因的H3K14和H3K27位點(diǎn)(Benhamed等, 2006)。H4R3能夠被AtPRMT5/SKB1對(duì)稱性的二甲基化(Pei等, 2007。組蛋白賴氨酸甲基化是一種非常重要也是非常復(fù)雜的表觀遺傳修飾，不同位點(diǎn)的修飾和修飾的程度分別與轉(zhuǎn)錄激活或沉默相關(guān)。最后，MET1的下調(diào)可以保證由DME產(chǎn)生的半甲基化位點(diǎn)不會(huì)被再次全甲基化。圖12 植物中的DNA主動(dòng)去甲基化及其生物學(xué)功能(He等，2011)。DME主要在配子發(fā)生時(shí)起建立印記的功能(Huh等, 2008)，而其它該家族成員主要在營(yíng)養(yǎng)器官中起作用，可能用于修復(fù)RdDM途徑產(chǎn)生的過度甲基化(Kapoor等, 2005。另外一些位點(diǎn)的CHH甲基化是由CMT3和DRM2共同決定的(Cao等, 2003)。 Zilberman等, 2007)。RDM1(RNAdircted DNA methylaton 1)是在篩選擬南芥轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Transcriptional gene silencing, TGS）突變體中發(fā)現(xiàn)的，在RdDM效應(yīng)復(fù)合體中與AGO4和DRM2互作。與常規(guī)的RNA聚合酶II（Pol II）類似，Pol IV和Pol V也是由多個(gè)亞基組成的蛋白復(fù)合體，它們各自包含特有的亞基，同時(shí)也共享一些亞基，或與Pol II共享一些亞基(Huang等, 2009。 從頭合成DNA甲基化從頭合成DNA甲基化是指RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（圖11）。Asano等（2009）從N甲基N亞硝基脲（MNU）誘變的突變體庫中篩選到三個(gè)半顯性矮稈突變體Slr1d，圖位克隆后發(fā)現(xiàn)均來自DELLA蛋白SLR1的功能獲得性突變。Tong等（2009）發(fā)現(xiàn)一個(gè)矮化少蘗突變體dlt(dwarf and low tillering)，DLT編碼一個(gè)植物特有的GRAS家族蛋白，并且OsBZR1蛋白能結(jié)合到DLT的啟動(dòng)子，這與DLT對(duì)BR處理的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制相一致。BRD2編碼擬南芥的同源蛋白DIM/DWF1，催化從24亞甲基膽固醇（24methylenecholesterol）到油菜甾醇（campesterol）這一過程(Hong等, 2005)。 Hartweck等, 2006)。Sakamoto等（2004）利用其它物種中已知的赤霉素合成酶基因，從水稻基因組數(shù)據(jù)庫中分離了水稻赤霉素合成途徑中的29個(gè)候選同源基因。赤霉素是廣泛存在的一大類植物激素的總稱，其化學(xué)結(jié)構(gòu)都屬于二萜類酸，由四環(huán)骨架衍生而來。盧永根等（1979）和顧銘洪等（1988）對(duì)我國(guó)秈稻品種的矮生性遺傳作了系統(tǒng)性研究，發(fā)現(xiàn)我國(guó)秈稻中存在的矮稈基因有四個(gè)：sdsdg、sdn(t)和sdt(t)。 Holliday, 2006)。 Epigenetic mutation。盡管FIE1在回復(fù)突變株中保持沉默，但DNA甲基化并未恢復(fù)到野生型水平，發(fā)生恢復(fù)的位點(diǎn)主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近和第3個(gè)外顯子。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。目前正在進(jìn)行的超級(jí)稻育種主要利用理想株型和秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)以期水稻單產(chǎn)得到進(jìn)一步提高。與擬南芥僅有一個(gè)FIE基因不同，水稻含有兩個(gè)FIE基因，另一個(gè)FIE基因FIE2是組成性表達(dá)的，因此我們推測(cè)水稻基因組復(fù)制以及隨后的進(jìn)化過程中，表觀遺傳修飾對(duì)兩個(gè)FIE基因的功能分化起了重要作用。矮稈資源的合理利用是水稻株型改良的基礎(chǔ),是兩次單產(chǎn)突破的關(guān)鍵。根據(jù)株高矮化的程度，廣義的矮稈又分為半矮稈、矮稈和極矮稈3種類型。江光懷（2002）利用矮泰引2號(hào)和無葉舌標(biāo)記基因系B30為材料,將sdt(t)基因定位在水稻第4染色體約147kb的范圍內(nèi)。 Sasaki等, 2002。水稻中最早發(fā)現(xiàn)的赤霉素不敏感突變體是dwarf1，表現(xiàn)矮化、葉寬且深綠、花序緊湊和小粒等表型。 Bishop等, 2001。Tos17插入突變體oscpd11并未表現(xiàn)出BR缺陷型表型，作者推測(cè)它們之間存在功能冗余。 水稻顯性矮稈突變體的研究進(jìn)展雜種優(yōu)勢(shì)的利用是增加水稻生物學(xué)產(chǎn)量的有效途徑之一,特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用可以大幅度提高產(chǎn)量(袁隆平, 2008)。2010年Science上發(fā)表的表觀遺傳學(xué)專題認(rèn)為表觀遺傳應(yīng)符合三個(gè)特征：可遺傳、能自我復(fù)制和可逆(Riddihough等, 2010)。RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNAdirected DNA methylation, RdDM）在植物中是非常保守的，這種機(jī)制在轉(zhuǎn)類病毒基因的馬鈴薯中第一次被發(fā)現(xiàn)(Wassenegger等, 1994)。除了siRNA外，RdDM還需要Pol V來合成非編碼RNA(Wierzbicki等, 2008)。NRPD/ENRPD/ENRPE5以及最大的亞基NRPD1/E1的功能已經(jīng)通過遺傳和生物化學(xué)的手段得以證實(shí)(Herr等, 2005。因此，編碼區(qū)DNA甲基化的功能還有待進(jìn)一步確定。植物中的主動(dòng)去甲基化是由DNA糖基化酶通過堿基切除修復(fù)機(jī)制（Base excision repair，BER）來完成的(Ikeda等, 2009。目前發(fā)現(xiàn)DME僅僅激活三個(gè)母本基因：MEA（MEDEA），F(xiàn)WA（FLOWERING WAGENINGEN）和FIS2（FERTILIZATION INDIPENDENT SEED 2）,而在動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)大約80個(gè)印記基因。值得注意的是MSI1和RBR1也是印記基因FIS2和FWA選擇性母本表達(dá)所必需的(Jullien等, 2008)，這表明MET1下調(diào)引起的被動(dòng)去甲基化和DME控制的主動(dòng)去甲基化共同調(diào)控印記基因的激活。組蛋白的核心是由一個(gè)球型的結(jié)構(gòu)域和暴露在核小體表面的N端尾區(qū)域組成的。 Springer等, 2003。除了晚花表型，atprmt5突變體還表現(xiàn)出另外多種表型，包括生長(zhǎng)阻滯和葉片暗綠并卷曲，表明AtPRMT5/SKB1在發(fā)育過程中起重要作用(Pei等, 2007。組蛋白乙?；膭?dòng)態(tài)平衡取決于HATs和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)的相互拮抗。因此，組蛋白乙酰化長(zhǎng)期以來被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄激活以及其它細(xì)胞過程如DNA復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)(Lee等, 2007)。在哺乳動(dòng)物中，PRMT1和PRMT5是主要的催化H4R3單甲基化和非對(duì)稱性或?qū)ΨQ性二甲基化的type I和type II類型甲基轉(zhuǎn)移酶。哺乳動(dòng)物和酵母中組蛋白H4第20位的賴氨酸（H4K20）受甲基化修飾，而在擬南芥中盡管利用免疫共沉淀的方法曾發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在單甲基化修飾，但主要是受乙?；揎?Naumann等, 2005)。被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化可能是相互協(xié)調(diào)起作用的，另外一些觀察結(jié)果也符合這一假設(shè)。ros1 dml2 dml3三突變體與野生型相比，盡管整個(gè)基因組水平上的甲基化水平相似，但發(fā)現(xiàn)179個(gè)位點(diǎn)甲基化水平降低。通常DNA糖基化酶在BER中能識(shí)別和移除突變的殘基，包括氧化和烷基化的堿基，以及由甲基化的胞嘧啶脫氨基造成的T/G錯(cuò)配堿基(Baute等, 2008)。DNA甲基化和組蛋白甲基化之間的關(guān)聯(lián)也反映在CMT3和KYP蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域上。 He等, 2009)，而NRPE5專一性的存在于Pol V中(Lahmy等, 2009。AGO4與KTF1蛋白的結(jié)合反過來又加強(qiáng)了siRNA與Pol V轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)合，從而形成有功能的RdDM效應(yīng)復(fù)合體，該復(fù)合體能引導(dǎo)從頭合成甲基化酶DRM2(Domains rearranged methylase 2)結(jié)合到Pol V的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)從而使該位點(diǎn)甲基化(Zilberman等, 2003。 Kanno等, 2005。哺乳動(dòng)物DNA甲基化的缺陷會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡，而植物中DNA甲基化缺陷雖然不致死，但常常會(huì)導(dǎo)致多種形態(tài)上的突變。Wei等（2006）將D53基因定位于第11染色體短臂末端。酵母雙雜交結(jié)果表明1433蛋白與OsBZR1互作。施加外源BR后突變表型得到恢復(fù)。SLR1編碼DELLA結(jié)構(gòu)域蛋白，DELLA結(jié)構(gòu)域在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)赤霉素的響應(yīng)非常重要(Ikeda等, 2001)。EUI編碼一種細(xì)胞色素P450，主要在節(jié)間分裂旺盛的區(qū)域表達(dá)，它能使有活性的GA4通過16a，17脫羥基反應(yīng)而失活。根據(jù)植物矮化突變體對(duì)外源激素的反應(yīng),可將其分為缺陷型和不敏感型兩類。水稻矮稈遺傳主要有兩種類型：一類是由單基因控制的質(zhì)量性狀遺傳，另一類是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。經(jīng)典遺傳學(xué)指出,基因結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起生物體表現(xiàn)型的改變,這種改變可以從上一代傳遞到下一代。染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明FIE15’端存在高水平的H3K9me2，而Epidf中H3K9me2水平降低引起FIE1異位表達(dá)和基因組水平上H3K27me3分布異常，從而導(dǎo)致水稻發(fā)育缺陷。Epidf與秈稻品種培矮64正反交F1株高介于兩者之間，F(xiàn)2代分離群體中高株和矮株數(shù)比例接近1：3，表明Epidf表型是由單顯性核基因控制。分類號(hào) S511 學(xué) 號(hào) 2008201008 博士學(xué)位論文水稻顯性矮稈基因Epidf的圖位克隆、表觀修飾特征分析及功能研究張 立 國(guó)指導(dǎo)教師萬建民 教授專業(yè)名稱遺 傳 學(xué)研究方向水稻分子遺傳答辯日期二○一二年十二月113 / 129POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epidf IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ByZhang LiguoA dissertation submitted toNanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements for Doctoral Degree SupervisedByProfessor Wan JianminDepartment of Crop Genetics and Breeding Nanjing Agricultural University Nanjing 210095, December 2012原 創(chuàng) 性 聲 明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。主要研究結(jié)果如下：（1）Epidf從苗期至成熟期表現(xiàn)矮化，并且與野生型雜交F1表現(xiàn)類似突變體的表型，因此，Epidf屬于顯性矮稈突變體。（5）H3K9me2和H3K27me3是與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)非常保守的兩種表觀遺傳修飾， H3K9me2主要集中在異染色質(zhì)，起抑制轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座的功能；H3K27me3基本存在于常染色質(zhì)，起抑制基因轉(zhuǎn)錄和維持細(xì)胞記憶的功能。表觀遺傳調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成部分，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。除dn類型外，其余類型都存在某一特定節(jié)間的縮短，這表明不同矮化基因作用于不同的節(jié)間伸長(zhǎng)。近年來植物分子遺傳學(xué)的發(fā)展,使植物激素對(duì)植物生理影響的研究逐步深入到分子水平。eui(elongated uppermost internode)突變體在水稻雜交制種過程中得到廣泛利用，它能使不育系的第一節(jié)間伸長(zhǎng)從而使穗部從劍葉葉鞘中伸出，從而接受恢復(fù)系的花粉。水稻中的GAI同源基因是SLR1，slr1(slender rice1)突變體植株苗期細(xì)長(zhǎng),并且對(duì)赤霉素反應(yīng)不敏感。d2(dwarf2)是發(fā)現(xiàn)的另外一種BR缺陷型突變體，株高為野生型的7080%，第二節(jié)間縮短，葉傾角變小。OsBZR1的RNAi植株表現(xiàn)出矮化、直立葉、BR敏感性降低和BR響應(yīng)基因表達(dá)等表型，表明OsBZR1在水稻BR信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。Iwata等（1977）通過γ射線誘變農(nóng)林8號(hào)得到的D53是最早報(bào)道的顯性半矮稈突變體。 DNA甲基化DNA甲基化是一種在進(jìn)化上非常保守的控制基因沉默的表觀修飾方式，DNA甲基化現(xiàn)象廣泛存在于細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物中,是DNA的一種天然的修飾方式，這種修飾對(duì)生物體的發(fā)育非常重要(Colot等, 1999)。RdDM途徑中的許多組分已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中包括兩個(gè)植物特有的DNA依賴型RNA聚合酶（Pol IV和Pol V），它們分別含有NRPD1和NRPE1兩個(gè)大亞基(Herr等, 2005。 Wierzbicki等, 2009)。NRPD/E2和NRPD/E4為Pol IV和Pol V共有(Kanno等, 2005。 Jackson等, 2004)。 MoralesRuiz等, 2006) 。通過比較rosdml2和dml3單突變體的基因組甲基化水平，證明這三個(gè)糖基化酶存在功能冗余(Penterman等, 2007)。盡管在動(dòng)物中還未發(fā)現(xiàn)這些蛋白對(duì)印記的直接影響，但觀察到的一些現(xiàn)象表明這些蛋白的功能是非常保守的(Jullien等, 2008)。這些修飾是由不同的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(HKMTs)催化的(Liu等, 2010)。這兩類精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化精氨酸生成作為中間產(chǎn)物的單甲基化精氨酸，該單甲基化精氨酸被type I PRMTs催化形成非對(duì)稱的二甲基化精氨酸，然后再被type II PRMTs催化形成對(duì)稱性的二甲基化精氨酸(Bedford等, 2009)。 組蛋乙?；M蛋白乙酰化是指增加一個(gè)乙?；鶊F(tuán)到組蛋白賴氨酸殘基上從而中和賴氨酸殘基所攜帶的正電荷，從而影響組蛋白與其它蛋白或DNA之間的相互作用，使DNA從濃縮狀態(tài)釋放出來。擬南芥HDACs分為RPD3/HDA1超家族、SIR2家族和HD2家族(Pandey等, 2002)。 Wang等, 2007。 Zhao等, 2004)。組蛋白N端尾部的1538個(gè)氨基酸殘基是翻譯后修飾的主要位點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)DNA的生物學(xué)功能。在哺乳動(dòng)物中，DNMT1(DNA me