【正文】 2022/6/4 90 復(fù)習(xí)題 ? G10凝膠色譜系統(tǒng)試驗(yàn)中凝膠的預(yù)處理要求？ ? 1）新使用的凝膠：充分溶脹，室溫 20℃ 需 3小時(shí)以上，煮沸需 1小時(shí)，凝膠充分溶脹后漂去細(xì)粒。 ? 關(guān)系密切；在固體條件下主要和 含量有關(guān)。如果在色譜柱很熱的時(shí)候停泵，當(dāng)流動(dòng)相冷卻過(guò)程中色譜柱就會(huì)進(jìn)入氣泡。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。 2022/6/4 71 ?凝膠溶脹方法： 稱取葡聚糖凝膠，緩慢地傾倒入 5～ 10倍的 去離子水中 或 蒸餾水 ，攪拌均勻，在室溫溶脹 6小時(shí)，或 沸水浴溶脹 2小時(shí) ，一般采用后一種方法（能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡） 。 對(duì)照品峰和供試品溶液聚合物峰與相應(yīng)色譜中藍(lán)色葡聚糖 2022峰的保留時(shí)間的比值也是 ～ 。 β內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的測(cè)定采用分子排阻色譜法。 ?（ 5）在深入研究藥物和葡聚糖凝膠的相互作用及流動(dòng)相對(duì)該相互作用的影響的基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)色譜過(guò)程中的 流動(dòng)相組成、濃度、 pH和流速 等參數(shù)，調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠顆粒間的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離度。 2022/6/4 22 凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖 2022/6/4 23 ?凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。 2022/6/4 14 ? 固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與 含水量 和 貯存溫度 的關(guān)系密切。 2022/6/4 5 202468101214160 20 40 60 80 100溫度℃圖 1 水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化 2022/6/4 6 β內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì) ?三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征 ? （一）青霉類抗生素：高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。 2022/6/4 3 β內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì) ?二、分類及來(lái)源 按其來(lái)源分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。 完全抗原：同時(shí)具備 2個(gè)性質(zhì)。 2022/6/4 11 β內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì) ?四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 高度的不均一性和不確定性。 ?以葡聚糖凝膠 Sephadex G10 為基礎(chǔ)的凝膠色譜分析方法，可簡(jiǎn)便地用于對(duì)各種 β內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的分離、分析，并滿足藥品質(zhì)量控制的需要。 2022/6/4 27 凝膠層析洗脫示意圖 （ 1）完全排阻的大分子 （ 2）中等分子 （ 3）完全滲透的小分子 （ 4）吸附分子 2022/6/4 28 ?通常選用藍(lán)色葡聚糖 2022作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。 當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸 /鹽存在時(shí)， pH通過(guò)影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。 2022/6/4 50 ? 2. 歸一化法 將測(cè)得色譜圖上， 所有色譜峰 面積求和，與每個(gè)色譜峰面積相比較，即得每個(gè)色譜峰的百分比，把所有的色譜峰的百分比相加即得 100%，稱為峰面積歸一化。 2022/6/4 68 分離度影響因素 ? ? ? ? pH有關(guān) ? 2022/6/4 69 第四節(jié) Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù) ? 凝膠： 溶膠 或 溶液 中的 膠體 粒子或 高分子 在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的 液體 （在干凝膠中也可以是 氣體 ），這樣一種特殊的 分散體系 稱作凝膠。在柱中加水或洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的出口關(guān)閉。 2022/6/4 78 色譜柱的維護(hù)保養(yǎng) ?玻璃層析柱： ? ，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，避免因此而壓緊凝膠。 2022/6/4 84 復(fù)習(xí)題 ?一、 ?1. β內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)：對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。 2022/6/4 88 復(fù)習(xí)題 ? ？ ?利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含青霉素 V 聚合物（青霉素 V 計(jì)）占標(biāo)示量的百分比。 ? 2)頭孢菌素的聚合物 ? 固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度的關(guān)系密切。在 2022版中國(guó)藥典中，發(fā)展較為完善的 Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種抗生素高分子雜質(zhì)的控制有著重要的意義。 凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。 2022/6/4 73 ? 取層析柱一根，底部用玻璃纖維或砂蕊濾板襯托，并要求濾板下的體積 盡可能小 。 vpHHvp ?/Hp ——次高峰到基線的高。 高聚物對(duì)照品較難制備，即使制備的高聚物對(duì)照品由于不穩(wěn)定也較難保存，而且不同批制備的對(duì)照品很難同質(zhì)。 2022/6/4 38 流動(dòng)相 頭孢菌素的 Kav值 頭孢他啶 頭孢曲松 頭孢噻吩 檸檬酸緩沖液 硫酸銨 磷酸緩沖液 醋酸緩沖液 碳酸鹽緩沖液 硝酸鈉 流動(dòng)相中緩沖液種類對(duì)頭孢菌素色譜行為的影響 2022/6/4 39 測(cè)定次數(shù) 緩沖鹽 1 磷酸緩沖液 3191 檸檬酸緩沖液 2385 2 磷酸緩沖液 4121 檸檬酸緩沖液 3120 流動(dòng)相對(duì)頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為的影響 2022/6/4 40 ?分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的 陰離子種類 ，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的 Kav值相對(duì)越大，色譜峰也越易拖尾。 一般是介于 Vo和 Vt之間的。 2022/6/4 17 第二節(jié) 高分子雜質(zhì)分析方法 高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法 化學(xué)分析 免疫學(xué)分析 色譜法 分光法（ P值法） 間接血凝法 豚鼠 PCA法 反相模式 離子交換模式 凝膠色譜模式 一、概述 2022/6/4 18 ?由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏性雜質(zhì)，因此，在藥物質(zhì)量控制中一般 不需 分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的 總量 。 N型聚合反應(yīng) eg. 頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等