【正文】 穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。 20221022 138 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 5）血影細(xì)胞介導(dǎo)法 血影細(xì)胞 是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。 利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒 DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。 20221022 130 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）人牛痘病毒 DNA表達(dá)載體的構(gòu)建 目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒。 20221022 125 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 4）利用 SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序 20221022 126 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 5） SV40 DNA載體的特點(diǎn) ?基因表達(dá)好： 外源基因能高效表達(dá) ?基因重排高： 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象 ?宿主范圍窄： 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞 ?裝載量較小 20221022 127 目的基因在宿主中的表達(dá) 人乳多瘤病毒 DNA（ BKV） （ 1）人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性 人乳多瘤病毒（ BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈 DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá) 500個(gè)拷貝。 ?SV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白 H H H4結(jié)合，從而使其 DNA形成類似 核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。 不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因 hprt與之遺傳互補(bǔ)。 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組 HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的 1%2%。 20221022 103 目的基因在宿主中的表達(dá) 乙肝病毒是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ，具有感染力的病毒顆粒呈球面 狀，直徑為 42 nm， 基因組僅為 kb。 在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。 20221022 96 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）超誘導(dǎo)型啟動子 釀酒酵母的半乳糖利用酶系由 GAL GAL7和 GAL10基因編碼。g DNA。這樣，目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體 DNA區(qū)域。 拷貝數(shù)為 50100個(gè)，分別攜帶 K1 K2兩種能使多種酵母菌致死的毒 素蛋白編碼基因（ αβγ），同時(shí)含有毒素蛋白抗性基因。 UBA1缺陷型： UBA1編碼泛素激活酶 E1， UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與 b內(nèi)酰胺酶 基因拼接， b內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。 1987年， Novo公司推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。重組質(zhì)粒逃逸的原因有： ?高溫培養(yǎng)、表面活性劑（ SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏； ?受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒； ?重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇。 20221022 52 目的基因在宿主中的表達(dá) ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa1 Ile Glu Gly Arg Glu ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位點(diǎn) 20221022 53 目的基因在宿主中的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 構(gòu)建串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷 貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可 達(dá)到 85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的 N端不含甲 硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。 ?外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。通過在 DNA水平 上人工設(shè)計(jì)引入蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在 體外從純化的融合蛋白分子中釋放異源蛋白。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少 數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，其表達(dá)效率通常要比包涵體方式 低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌 盡管有，但并不普遍。 二硫鍵交換（ B）： 需要還原型和氧化型谷胱甘肽（ GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好。 分段稀釋法： 逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生。 20221022 36 目的基因在宿主中的表達(dá) 包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是在人工條件下，拆開包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)中錯(cuò)配的二硫鍵和次級鍵，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑 。 除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對外源基因高效表達(dá)的制約作用。 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有 與啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的。 ③ SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 ④ 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 20221022 20 目的基因在宿主中的表達(dá) (2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對外源基因表達(dá)的影響 ?SD序列的影響： 一般來說， mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效 率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD序列與 16S rRNA的堿 基互補(bǔ)性， 其中以 GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程 中往往添加 IAA誘導(dǎo) Ptrp介導(dǎo)的目 基因的表達(dá)。 ?更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。 ?過長的 mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸 或者加入 3吲哚丙烯酸（ IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 ② 翻譯起始密碼子： 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起 始位點(diǎn)，但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子。除此之外，從 AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿 基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形 成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴(yán)重干擾 mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè) tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。 由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源 或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體 法的長處所在。 包涵體復(fù)性操作的方法包括： 一步稀釋法： 蛋白復(fù)性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大。形成二硫鍵的方式主要有： 化學(xué)氧化法（ A）： 需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊。 20221022 41 目的基因在宿主中的表達(dá) 分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健 全。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常 受體細(xì)菌的蛋白部分位于 N端，異源蛋白位于 C端。 20221022 46 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則： ?受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)， 且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和 層析進(jìn)行特異性簡單純化。 其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段 N 端的第一位氨基酸殘基保持不變。 由于 Xa的識別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大 多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛 用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。 20221022 59 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）重組質(zhì)粒的逃逸率 當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中 一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為 稱為 重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率 。 20221022 目的基因在宿主中的表達(dá) 64 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。 20221022 71 目的基因在宿主中的表達(dá) A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 20221022 72 目的基因在宿主中的表達(dá) 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌 泛素降解途徑衰減的釀酒酵母 UBI 4缺陷型： 在釀酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4基因表達(dá)， UBI 4缺陷突變株能正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。 20221022 83 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒 乳酸克魯維酵母中含有兩種不同 的雙鏈線狀質(zhì)粒 pGKL1和 pGKL2。 目的基因表達(dá)盒通常插在染色體 DNA特定序列中。 ?電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是 不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件，適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá) 105 / 181。 因此，裝在 pho4TSPHO5啟動子下游的外源基因在 35℃ 時(shí)關(guān)閉， 23℃ 誘導(dǎo)表達(dá)。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體 DNA上。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對預(yù)防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。 20221022 106 目的基因在宿主中的表達(dá) 20世紀(jì) 80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組 HBsAg， 主要工作包括將 S多肽的編碼置于 ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為 22 nm， 其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。 20221022 114 目的基因在宿主中的表達(dá) 高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記 20221022 115 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 1）營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞 ?含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（ tk） 不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因 tk能與之遺傳互補(bǔ)。 20221022 121 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）腺病毒 DNA載體的特點(diǎn) ?基因重排低： 外源基因與病毒 DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期 ?安全性能好： 不整合人的染色體 DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤 ?宿主范圍廣： 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格 ?使用效果好： 外源基因在載體上容易高效表達(dá) 20221022 122 目的基因在宿主中的表達(dá) 猴多瘤病毒 DNA（ SV40） （ 1） SV40的生物學(xué)特性 ?SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP VP VP3三種 衣殼蛋白 包裝而成，基因組為 5224bp的雙鏈環(huán)狀 DNA。 該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔 β珠蛋白。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外 D NA重組很困難，因此通常采用 體內(nèi)重組 的方式進(jìn)行。 在外源 DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性 DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。 上述程序 多用于動物個(gè)體的轉(zhuǎn)基因過程 ，由于必須單細(xì)胞逐一操作，所以 不太適用于基因的克隆和表達(dá)。 氨甲喋呤（ MTX） 是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶（ DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的