定量pcr基本原理及方法(更新版)
【正文】 ? 定量 PCR技術(shù)的產(chǎn)生 1992年由 Higuchi等人第一次報告：使用 EB加入 PCR反應(yīng)體系 ，經(jīng)改裝的帶有冷 CCD的 PCR儀檢測樣品的熒光強度 核酸 ? 染料熒光 后來用與雙鏈 DNA有更強結(jié)合力的 SYBR Green I取代 EB 一． 熒光定量 PCR基本原理 Realtime Chemistries PCR的 理論方程： Y=x (1+ Ev)n Y：擴增物數(shù)量； X ：起始模板數(shù)量； Ev：擴增效率； n：擴增循環(huán)數(shù) 1. 終點法定量原理 前提：在最佳實驗 、 循環(huán)次數(shù) n一定 、 Ev相同 原理：根據(jù)擴增產(chǎn)物的量計數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù) ， 即： lnx=lnYn ln(1+Ev)=lnY b (b為常數(shù) ) 2. 實時檢測法定量原理 前提：在最佳實驗 、 相同 Ev以 、 擴增產(chǎn)物量相同 原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù) （ X） 與其所需要的擴增循環(huán)次數(shù) （ n）成反比 ， 由此計算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量 ， 即： LgX=LgY–n Lg(1+Ev)=b n a (a、 b為常數(shù) ) ? 熒光定量 PCR的定量原理 閾值 ： PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定的對數(shù)增長期時的熒光值 。 ? 利用擴增信號的種類來分型 雜合型 野生型 突變型 FRET探針進行熔解曲線分析確定基因型 FRET探針與模板結(jié)合時 ， 因共振能量的傳遞而信號增強 ， 而當(dāng)在 Tm 值時 ，F(xiàn)RET探針與 PCR產(chǎn)物分開 ， 熒光信號減弱 。 ? 利用熔解曲線檢測基因突變 謝謝 ！ 專才服務(wù)專家
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