【正文】 的控制 (1) 罐壓： 罐壓直接影響發(fā)酵液中氧的分壓 ， 我們知道氧是一種難溶于水的氣體 ， 氧在發(fā)酵液中的溶解度不僅受培養(yǎng)基成分的影響 ， 而且當各類物質濃度增加時 ， 氧的溶解度也要降低。對菌絲生長和青霉素合成來說 ， 最適溫度不是一樣的 ， 一般前者略高于后者 ， 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間 ， 到達生產階段后便適當降低溫度 ， 以利于青霉素的合成。 因此采用補料分批發(fā)酵 可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時間地保持在一定范圍內，既保 證青霉素 的生長需要，又不造成不利影響， 還 可以避免在分批發(fā)酵中因一次性投入糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多，以至通風攪拌設備不能匹配的狀況， 從而 提高有用產物的轉化率 ，所以本設計采用補料分批發(fā)酵方式進行青霉素的發(fā)酵生產。 ② 避免在培養(yǎng)基中積累有毒代謝物，即代謝阻遏。由于上述情況，連續(xù)發(fā)酵目前主要用于研究工作中，如發(fā)酵動力學參數的測定，過程條件的優(yōu)化試驗等等，而在工業(yè)生產中的應用還不多。 其優(yōu)點是：①對溫度的要求低，工藝操作簡單；②比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題；③對營養(yǎng)物的利用效率較高，產物濃度也比 連續(xù)發(fā)酵 要高。 6APA 也可從青霉素 G 用化學法來裂解制得，但成本較高。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣、攪拌，第二章 工藝設計 7 在 27 ℃ 下培養(yǎng) 24～ 28h，然后將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐已滅菌的含有 苯乙酸 前體的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，攪拌，在 27 ℃ 下培 養(yǎng) 7 天。除此之外，發(fā)酵液的 pH 值、溫度和溶解氧濃度等都會影響發(fā)酵過程中的代謝變化，進而影響青霉素產量，必須予以嚴格控制。隨著菌體四川理工學院畢業(yè)設計 6 濃度的不斷增加，攝氧率不斷增大，溶解氧水平不斷降低。目前普遍采用淀粉經淀粉酶水解的葡萄糖糖化液（ DE值 50%以上）進行流加。 對溶血性鏈球菌等鏈球菌屬，肺炎鏈球菌和不產青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。對革蘭陽性球菌及革蘭陽性桿菌、 螺旋體 、 梭狀芽孢桿菌 、 放線菌 以及部分 擬桿菌 有抗菌作用。革蘭氏陽性菌細胞壁的組成是肽聚糖占細胞壁干重的 50％～ 80％（革蘭氏陰性菌為 1％～ 10％）、磷壁酸質、多糖 、 脂蛋白和蛋白質。 青霉素的分子通式為： RC9O4H11 N2 S 第一章 緒論 3 結構通式可表示為下圖： 圖 11 青霉素結構通 式 然而青霉素發(fā)酵液中含有 5 種以上天然青霉素（如青霉素 F、 G、 X、 K、 F 和 V 等），它們的差別僅在于側鏈 R 基團的結構不同，其中青霉素 G 在醫(yī)療中用得最多，它的 鉀 或 鈉 鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對革蘭氏陰性菌也有強大的抑制作用 。上世紀 80 年代后，世界青霉素生產格局發(fā)生了翻天覆地的變化。 青霉素發(fā)展歷程 1953 年 5 月，中國第一批國產青霉素誕生，揭開了中國生產抗生素的歷史。經實驗和臨床試驗證明，它毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌所引起的許多疾病有卓越的療效。它的研制成功 大大增強了人類 抵抗細菌性感染的能力，帶動了抗生素家族的誕生。 經工藝計算， 設計 選 用 2 臺 一級 種子罐、 3 臺二級種子罐、 6臺發(fā)酵罐。 廠房采用三層設計，在不同層放置不同類型的罐體，以滿足生產需要 。 20 世紀 40 年代前， 人們 一直未能掌握一種能高效治療細菌性感染且副作用小的藥物。 此后一系列臨床實驗證實了青霉素對 白喉桿菌 、 鏈球菌等多種細菌感染的療效。在 1996年得到迅速擴展，當時全球青霉素原料藥年產銷量達 4 萬噸左右，其中中國的青霉素在國際市場的份額占到 30%，且出口量猛增。中國青霉素工業(yè)鹽的產量從 90 年代的初的約占世界總產量的三分之一逐步增加到目前的 90%以上。 青霉素的單位 目前國際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位（ unit）；二是活性質量（ μg），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是： 50mL 肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標準金葡萄菌生長的青霉素量為一個青霉素單位。其中肽聚糖是一種含有乙?；?葡萄糖胺和短肽單元的網狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關鍵的酶即轉肽酶。 對 溶血性鏈球菌 等 鏈球菌屬 ， 肺炎鏈球菌 和不產 青霉素酶 的葡萄球菌具有良好抗菌作用。對腸球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽孢桿菌、牛型放線菌、念珠狀鏈桿菌、李斯特菌、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體對本品敏感。 ⑵ 氮源 選用玉米漿、玉米餅粉等并補加無機氮源。當達到菌的臨界濃度時，攝氧率達到最大，溶解氧降至最小。 此階段一般又稱為青霉素分泌期或發(fā)酵中期。在發(fā)酵過程中需補入苯乙酸前體及適量的培養(yǎng)基。側鏈的引入系將相應的有機酸先用氯化劑制成酰氯，然后根據酰氯的穩(wěn)定性在水或有機溶劑中，以無機或有機堿為縮合劑，與 6APA 進行?；磻Ｈ秉c是：①人力、物力、動力消耗較大；②生產周期較短，由于分批發(fā)酵時菌體有一定的生長規(guī)律，都 要經歷延滯期、對數生長期、穩(wěn)定期和衰亡期，而且每批發(fā)酵都要經菌種擴大發(fā)酵、設備沖洗、滅菌等階段； ③生產效率低，生產上常以體積生產率（以每小時每升發(fā)酵物中代謝產物的 g 數來表示）來計算效率，在分批發(fā)酵過程中，必須計算全過程的生產率，即時間不僅包括發(fā)酵時間，而且也包括放料、洗罐、加料、滅菌等時間。連續(xù)培養(yǎng)方法可用于面包酵母和飼料酵母的生產，以及有機廢水的活性污泥處理。與 連續(xù)發(fā)酵 相比， 流加發(fā)酵 不需要嚴格的 無菌 條件，也不會產生 菌種 老化 和 變異 等問題，因此，其應用范圍較廣。 工藝特點 本設計工藝為三級發(fā)酵 [3]，一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐。 在較低的通氣條件下，由于氧的溶解度是隨溫度下降而升高的，因此降低發(fā)酵溫度對發(fā)酵是有利的，因為低溫可以提高氧的溶解度、降低菌體生長速率、減少氧的消耗，彌補通氣效果差的不足。根據“亨利定律” 可用提高空氣進罐壓力來提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度 (取決于維持因數的大小 ， 維持因數越大 ， 呼吸強度越高 ) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學性質而異。 低溫水： 9～ 14℃ (△ t=5℃ )， （ MPa），用于夏天空氣后級冷卻及發(fā)酵控溫冷卻 。 (2) 種子罐公稱容積及臺數： 種子罐臺數 ?? 發(fā) 酵 罐 臺 數 種 子 罐 周 期發(fā) 酵 罐 周 期 37 24/)2556(6n ????中（臺） 故選擇 3 臺 二級種子罐可滿足生產?！?，冷卻水進口溫度 20℃，冷卻水出口溫度 25℃，取冷卻時間 ，計算可得所需冷卻水量 W冷 3000kg/hr? 則冷卻水高峰用量： hrtW /6 4 1 236 4 0 9m a x ??? (3) 低溫冷卻水（ 水溫 9～ 14℃，△ t=5℃， ，夏季使用） 低溫水用量（ c=水的 比熱容 從節(jié)能考慮 ， 完全可減小中、上道槳葉之葉徑。選用渦輪式攪拌器為理想 ，第四章 設備設計及選型 27 其特點是直徑小 ， 轉速快 ， 攪拌效率高 ， 功率消耗低 ， 其最大特點是攪拌時使料液產生徑向流 ， 可以延滯空氣在發(fā)酵液中的停留時間 ， 有利于氧在料液中溶解。 ② 配料用水： 培養(yǎng)基原料大多為固體 ? 配料用水量≈消后培養(yǎng)基體積 W發(fā) 酵 配 = ?二級配W mW ?一級配 ③ 自來水用量： 取安全系數 ，則自來水總用量： W總 = （ W發(fā) 酵 洗 2+W二 級 洗 +W一 級 洗 +W發(fā) 酵 配 2+W二 級 配 +W一 級 配 ） = （ 2+++ 2++） = 第四章 設備設計及選型 21 蒸汽 （ 121℃ ， 發(fā) 酵溫 度 =27 ℃ ， ? =， 焓 i =， 汽化 熱） (1) 發(fā)酵罐、二級種子罐空消所用蒸汽：（按 5 倍罐全容積計算） 5SSV ?? ? ?全 kg2 6 6 9 951 .7 2 9 9 6 ??大S ????中S (2) 一級種子罐、補料罐實消所用蒸汽：（以直接加熱之后保溫計算，料液比熱 Cs 均取 1kcal/kg （ 中n 即二級發(fā)酵罐， 小n 即一級發(fā)酵罐） 取二級發(fā)酵罐輔助時間為 25 小時，取一級發(fā)酵罐輔助時間為 30 小時 1? ? ?? 發(fā) 酵 罐 計 量 體 積 接 種 比 （ 流 體 損 失 率 ）種 子 罐 容 積 種 子 罐 裝 料 系 數 （流體損失率取 10%） 二級種子罐體積 2 0 0 8 0 % 1 5 % (1 1 0 % )70%? ? ? ?? = 取 38m3，計 算得公稱容積 ，全容積 一級種子罐體積 3 8 7 0 % 1 5 % (1 1 0 % )65%? ? ? ?? ? m3 第四章 設備設計及選型 17 取 ，計算得公稱容積 ，全容積 (3) 物料計算： 進料 =基礎培養(yǎng)基（消后） +種子液 +補料 出料 =發(fā)酵液 +逃液與蒸發(fā)損失 ① 發(fā)酵罐 發(fā)酵液 = 90%= m3 損失 =發(fā)酵液體積 3%= 3%= （損失率取 =3%） 種子 液 =發(fā)酵液體積 接種比 =15%= 補氨 = 48110 3= m3 補油 = 20110 3= m3 泡敵 = 20110 3= m3 補 料 = 320110 3= ∴消后培養(yǎng)基 =出料 +損失 種子 補氨 補油 泡敵 補料=+= ② 二級種子罐 出料 =發(fā)酵罐種子 = 損失 = 3%= m3 （損失率取 =3%） 種子 =15%= m3 ∴消后培養(yǎng)基 =出料 +損失 種子 =+= ③ 一級種子罐 出料 =二級種子罐種子 = m3 損失 = 3%= m3 （損失率取 =3%） 種子 =15%= m3 ∴消后培養(yǎng)基 =出料 +損失 種子 =+= 各階段物料添加量及損失，見圖 31. 四川理工學院畢業(yè)設計 18 圖 31 物料流程 圖 表 31 原料消耗表 原料名稱 規(guī)格 批次 用量（噸） 年用量（噸） 黃豆 餅粉 含蛋白質 45% 968 7741 葡萄糖 含量 99%以上 118 938 碳酸鈣 工業(yè)用含量 99%以上 4 29 KH2PO4 含量 99%以上 35 279 苯乙酰胺 工業(yè)用含量 99%以上 12 96 氨水 工業(yè)用含量 28% 28 220 油酸甘油酯 工業(yè)用含量 99%以上 81 645 豆油 工業(yè)用含量 95%以上 185 1480 硅油 工業(yè)用含量 99%以上 8 59 玉米油 工業(yè)用含量 85%以上 17 133 泡敵 工業(yè)用含量 89%以上 4 26 硝酸鉀 工業(yè)用含量 99%以上 4 29 第四章 設備設計及選型 19 能 耗計 算 水 (1) 發(fā)酵熱效應 [5] Q=QF 公V 發(fā)酵罐 大Q =5500 80%= 10 5 kJ/m3 第四章 設備設計及選型 15 蒸汽： 發(fā)酵車間用汽壓力 （ MPa） 。 第二章 工藝設計 13 發(fā)酵液質量控制 生產上按規(guī)定 時間從發(fā)酵罐中取樣 ， 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。 (2) 攪拌速度： 攪拌速度大與小關系到氣泡破碎是否良好 ， 空氣是否分散溶入液相 ， 增加氣液接觸的有效界面?zhèn)鬟f面積 ， 以利于氧的溶解和空氣的利用。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中 ， pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。主要補油、補糖、補氨水調解 pH。 青霉素 合成階段 ，青霉素的生產速率達到最大 ， 菌體重量增加，碳源、氮源等營養(yǎng)物質不斷消耗，青霉素不斷合成。 補料分批發(fā)酵 補料分批發(fā)酵又稱 流加發(fā)酵， 半連續(xù)發(fā)酵，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術，是指在微生物分批發(fā)酵中，以某種方式向培養(yǎng)系統補加一定物料的培養(yǎng)技術。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效地延長分批培養(yǎng)中的對數期。 因產天然青霉素法生產工藝較半合成青霉素法簡單，而且采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，每批次生產效率高，而半合成法對工藝要求較高，且中間物質較多，可能存在 生產中中間體轉化不完等因素，而且成本較高，所以本設計采用天然青霉素的生產方法。濾液在 pH2～ 的條件下，于萃取機內用醋酸丁酯進行多級逆流萃取，得到丁酯萃取液，轉入 ～ 的緩沖液中，然后再轉入丁酯中，將此丁酯萃取液經活性炭脫色，加入成鹽劑，經共沸蒸餾即可得青霉素 G 鉀鹽。此時發(fā)酵必須結束，否則不僅會使青霉素受到破壞，還會給發(fā)酵液過濾和提煉帶來困難。 青霉素合成階段 這個階段主要合成青霉素，青霉素的生產速 率達到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。一次加入量不能大于 %，并采用多次加入方式。 第二章 工藝設計 5 第二章 工藝設計 青霉素的生 產原料 菌種 常用菌種為產黃