【正文】 傷組織中有 70kD, 56kD， 32kD和一系列較小分子量 (20~26kD)的特異蛋白質(zhì)表達(dá)。 （ 2） mRNA差別顯示技術(shù) 在生物體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細(xì)胞 中發(fā)生的不同基因，按時間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方 式，叫基因的差異表達(dá) （ differential expression）。 36 體細(xì)胞胚發(fā)生中基因表達(dá)與調(diào)控 轉(zhuǎn)錄水平： mRNA含量 翻譯水平： 蛋白質(zhì)含量 (1)Northern雜交 (2)mRNA差別顯示技術(shù) (DDRTPCR技術(shù) ) (3) mRNA的體外翻譯 (1)蛋白質(zhì)的雙向電泳 (2)Western雜交 (3) ELLSA檢測技術(shù) (酶聯(lián)免疫吸附法 ) ● 表達(dá)與鑒定 : ● 調(diào)控 順式作用元件及其鑒出 :啟動子、增強(qiáng)子 反式作用因子 轉(zhuǎn)錄因子 DNA結(jié)合區(qū) 轉(zhuǎn)錄激活區(qū) 螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu) , 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 亮氨酸拉鏈 (leucine zipper)結(jié)構(gòu) 酸性功能區(qū) 谷氨酰胺豐富功能區(qū) 脯氨酸豐富功能區(qū) ； IAA、 CTK、 ABA、 2， 4D 5. DNA的甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控作用 一 .體細(xì)胞胚發(fā)生中特定遺傳信息的表達(dá) ： ● mRNA在細(xì)胞中的含量很低 (占總 RNA的 1%~5%), 每種特異 mRNA的含量則更少。 （一） KNOX基因家族： Ⅰ 亞家族： 主要在植物分生組織中表達(dá)，是分生組織發(fā)生與維持所必 須的關(guān)鍵基因，調(diào)控與器官發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞分化，最終影響側(cè) 生器官的形態(tài)建成。 ● 應(yīng)答 （ mtiment）： 產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞發(fā)生特異的細(xì)胞分裂，向形成器 官原基發(fā)育。 ◆ 寧夏枸杞葉片離體培養(yǎng)形成的再生植株根尖細(xì)胞染色體發(fā)生明顯變異。 由此推測 ,在胚性細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育過程中處于相對獨(dú)立狀態(tài) ,有利于胚胎發(fā)生潛力的表達(dá)。 “ 細(xì)胞生理隔離 ” 與 “ 組織生理隔離 ” ？ ● 合子胚： ◆ 被子植物的胚囊減數(shù)分裂后 ,形成的大孢子是與周圍細(xì)胞處于分開的狀態(tài)。這一特性是不穩(wěn)定 的。 167。 ATP酶的廣泛存在和保持較高活性為胚性細(xì)胞或原胚的一系列代謝提供了能量保證。 ?體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程與合子胚類似，第一次分裂多為不均等分裂，也有近似的均等分裂。被子植物中單子葉植物一 片子葉 , 雙子葉植物兩片子葉。 胚性細(xì)胞發(fā)生具有不同步性 胚性細(xì)胞的繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚。 四 .器官發(fā)生型 （ Organogenesis) 葉片、花藥 莖尖、根 五 .類胚體發(fā)生型 (Embryogenesis) 植物器官、組織和細(xì)胞 胚狀體 再 生成苗。 ▲ 特點(diǎn) : 利用外植體原有的芽，不僅繁殖率高 ,而且能保持該植物和的遺傳穩(wěn)定性。 二 . 胚珠和雌核的發(fā)育途徑 大孢子母細(xì)胞 (胚囊母細(xì)胞 ) 單倍性的四分體 減數(shù)分裂 只有遠(yuǎn)離珠孔端的一個細(xì)胞發(fā)育 胚囊細(xì)胞 8細(xì)胞胚囊 3次有絲分裂 1. 雌核發(fā)育 由單核至成熟胚囊時期均能誘導(dǎo)雌配子體的細(xì)胞 發(fā)育成愈傷組織。 ▲ B2 形成的兩個營養(yǎng)型細(xì)胞在以后的幾次分裂中是 不同步 的，其中一個停止分裂，或快或慢分裂，并存在于花粉的一側(cè)。在天仙子中發(fā)現(xiàn)此途徑。 ▲ AV 途徑：營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育成單倍性胚狀體，生殖細(xì)胞退化消失。即小孢子分裂成兩個大致相等、類似分生 細(xì)胞的營養(yǎng)型細(xì)胞，并連續(xù)不同分裂，形成不同倍性 的多細(xì)胞花粉。 研究花粉發(fā)育途徑的意義 : ● 研究花粉孢子體啟動第一次分裂的條件，揭示小 孢子發(fā)育過程中各種誘導(dǎo)因子對離體花藥 (花粉 )培養(yǎng) 的必要性。 ▲ 大米胚囊中的卵細(xì)胞、反足細(xì)胞、助細(xì)胞都可能產(chǎn)生胚，并認(rèn)為 ,卵細(xì)胞和反足細(xì)胞起源的原胚再生植株較好，助細(xì)胞僅產(chǎn)生愈傷組織。 非芽 芽型 石龍芮下胚軸胚狀體的發(fā)生 A、培養(yǎng)一個月的幼苗，下胚軸上產(chǎn)生許多胚狀體； B、下胚軸部分放大；C、兩個表皮細(xì)胞； D～ G 原胚發(fā)生過程； J、心形胚狀體； H、 I 已分化子葉、胚根及原維管束的胚狀體。在 胚發(fā)育早期 ,從二細(xì)胞胚至器官分化之前的胚胎發(fā)育階段稱為 原胚 (proembryo)時期。有實驗證明， ABA在控制 “ 重復(fù)胚胎發(fā) 生 ” 或 “ 畸形胚 ” 的形成是有效的。 紅豆衫細(xì)胞聚集體 3. 細(xì)胞膜上有分泌泡的形成： 其內(nèi)含一些被消化的細(xì)胞器和殘渣。因 為外源激素作用的部位是質(zhì) 膜，首先誘導(dǎo)膜蛋白的合 成，于是導(dǎo)致 膜 ATP酶 活性 提高。mol 用同位素脈沖標(biāo)記實驗可以證明，一些形成的胚性 細(xì)胞團(tuán)也是由一個單細(xì)胞連續(xù)分裂而形成的。 ● 小麥的胚性細(xì)胞的細(xì)胞核和質(zhì)向一端偏移 , 細(xì)胞器、核糖體和質(zhì)體等都有區(qū)域性集中分布現(xiàn)象 ,并和細(xì)胞核偏移的方向一致。 胚性細(xì)胞形成后，并不是所有的都能進(jìn)一步發(fā)育 成體細(xì)胞胚，這里除了培養(yǎng)誘導(dǎo)條件外，細(xì)胞間的 相互作用與競爭是重要的因素。 ◆ 人工種子的制作 ,優(yōu)良種質(zhì)的保存和無性系繁殖等 ,正是基于體細(xì)胞胚的基因型與原親本的相同性。 35 離體培養(yǎng)器官發(fā)生的調(diào)控機(jī)制 在合適的培養(yǎng)條件下，離體的組織或細(xì)胞可以脫分化、再分化形成任何我們所需的芽、根、葉、花，并逐步發(fā)育成完整的植株。 源于莖尖分生組織中的某些新細(xì)胞，即 “ de novol cells”理論（擬南芥）。 以擬南芥為例 ,擬南芥中有 4個 KNOX基因 : STM,BP,KNAT2和 KNAT6。 ● 斑點(diǎn)雜交與印跡雜交的區(qū)別： 斑點(diǎn)雜交 只需要將 RNA樣品點(diǎn)在固相膜上直接與 探針雜交。 從細(xì)胞中提取 RNA 體外翻譯系統(tǒng) + 除 Met外的 19 種氨基酸 +MgAc2+KAc+[35S]Met 30℃ 溫浴 蛋白質(zhì) 免疫沉淀或 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳進(jìn)行分析 (1)蛋白質(zhì)的雙向電泳 雙向電泳是將等電聚焦 IEF 和 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合 起來 ,依據(jù)蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn) 和 分子量 來分辨蛋白質(zhì)有關(guān)信息的 技術(shù)。其測定的靈敏度極高和具有較強(qiáng)特異性，是研究基因表達(dá)十分有效的方法。 ◆ 啟動子 (Promotor)是指 RNA聚合酶識別并與之 結(jié)合 ,從而起始轉(zhuǎn)錄的一段特異性 DNA序列 ,包括 TATA盒（控制轉(zhuǎn)錄啟動的準(zhǔn)確性）與 CAT盒（調(diào)控 轉(zhuǎn)錄的起始頻率）兩部分序列。 左圖 右圖 ② 鋅指 (Zinc finger)結(jié)構(gòu) 由多個重復(fù)的結(jié)構(gòu)組成，每個 分子中結(jié)合有 711個鋅原子， 每 2個半胱氨酸（ Cys）和 2個 組氨酸（ His）與一個 Zn原子結(jié) 合形成鋅指，一個完整的分子 可形成多個“指頭”，這有利于 DNA結(jié)合。 A G T A A i p 反密碼子 tRNA (2)生長素對基因表達(dá)的調(diào)控 ● 植物生長素能誘導(dǎo) mRNA的合成，而且能調(diào)控細(xì)胞內(nèi) mRNA的含量水平： ◆ 已克隆出幾個受植物生長素誘導(dǎo)的 mRNA的 cDNA ◆ 2,4D可以誘導(dǎo)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生中編碼富含脯氨酸的小分子蛋白質(zhì)基因 (MsPRP5)的表達(dá)；用 100 μmol/L 的 2,4D處理愈傷組織 20min，其 MsPRPS 的mRNA量開始增加 ,處理 2448h， mRNA的量達(dá)到峰值。 (2)特異 DNA序列的甲基化降低基因表達(dá)活性： ● 不活動或持續(xù)失活的基因甲基化程度較高 ,活躍 的或持續(xù)表達(dá)的基因常是低甲基化的；而具有組織 特異性表達(dá)的基因 5’ 端上游常呈低甲基化狀態(tài)。 思考題： 1． 花粉小孢子離體發(fā)育的基本途徑及其主要特點(diǎn)？ 2. 體細(xì)胞離體再生的基本類型及特點(diǎn)？ 3．胚性細(xì)胞分裂不同步性的可能原因是什么 ?有什么克服的方法 ? 4．體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基本過程及其特點(diǎn)？ 5. 花粉小孢子離體發(fā)育的 A、 B、 C途徑及其特點(diǎn)？ ? 7．胚性細(xì)胞形成過程中主要的生化變化 ? 8．體細(xì)胞胚起源的普遍觀點(diǎn)是什么 ?有何特點(diǎn) ? 9．體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的漸變理論的基本觀點(diǎn)是什么 ? 10．為什么體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中易發(fā)生遺傳變異 ,而且具有普遍性 ? 11．影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生變異性的主要因素是什么 ? 12．參與腋芽和分生組織發(fā)育的基因的類型與種類？ 13. KNOX基因的生物學(xué)與莖尖組織發(fā)育的關(guān)系？ ? 13. 何謂螺旋 轉(zhuǎn)角 螺旋、鋅指和亮氨酸拉鏈？ 14. 蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化對基因轉(zhuǎn)錄有和調(diào)節(jié)作用 ? 15. 體細(xì)胞胚發(fā)生中 DNA的甲基化對基因表達(dá)有何調(diào)控作用 ? 被子植物生活史 。 ● 培養(yǎng)細(xì)胞的分化率一般需要誘導(dǎo)，就是因為其甲基化程度較高，抑制了培養(yǎng)細(xì)胞中胚性相關(guān)基因的表達(dá)； 而通過激素、光溫條件等條件的誘導(dǎo)，降低 DNA甲基化程度，胚性相關(guān)基因才能表達(dá)，胚性細(xì)胞才能形成并進(jìn)一步