產植酸酶黑曲霉菌株s8-的基因擴增與鑒定(完整版)
【正文】 CR PhyA⒉⒉ PCR 體系的優(yōu)化結果梯度 PCR 結果最佳的反應體系是： MgCl 2 、Primer1 、 Primer2 、4dNTPmixture 、TaqDNA 聚合酶 (預變性后加)、H 2O ，反應總體積 。植酸酶的目的基因片段大小約為1500bp，將擴增產物與標準分子量對比，1500bp 左右的擴增條帶可初步判定為植酸酶的目的基因片段 ⑷ 。方法二：溶菌酶法 參照《工業(yè)微生物實驗技術手冊》 ，方法略有改動 ⑶ 。本試驗對自行分離鑒定的植酸酶高產、穩(wěn)產菌株 S8 進行了模板 DNA 的制備、PCR 引物的篩選、PCR 反應條件的優(yōu)化、目的片段的回收與酶切圖譜分析鑒定，這為植酸酶基因在適宜載體里的構建與表達提供了試驗材料和理論依據(jù)。對擴增出的目的片段用三種不同方法進行純化回收，結果是 PCR Fragment Recovery Kit 法回收效果最好，其產量可達到約 10ng/μL。根據(jù)已報道的植酸酶 sPhyA 基因序列酶切位點，對回收的目的片段進行酶切鑒定，該基因能被 BamHⅠ、SalⅠ酶切，不能被 HindⅢ、XbalⅠ、KPnⅠ酶切，與已知的 phyA 基因酶切圖譜基本一致，進一步判定 PCR 擴增產物中含有植酸酶 phyA 基因。⒈⒈試驗材料試驗用菌株 S8：為本試驗室自行分離鑒定和保存。方法三：改進的泛特津（Vitagene）試劑盒法 參照泛特津小量基因組 DNA 純化手冊（ Vitagene Genomic DNA Miniprep Handbook） ，方法略有改動。⒈⒉⒏ 植酸酶基因的純化和回收 用 3 種不同方法進行比較，確定最適純化和回收方案。最適 PCR 反應程序：94℃ 預變性 3min，65℃暫停 2min 加TaqDNA 聚合酶； 94℃變性 1min，56℃退火 1min，72℃延伸 2min，33 個循環(huán)后 72℃再延伸10min。從試驗中總結到：用液氮反復凍融、研磨得越充分（至少 10 次） ， 黑曲霉基因組 DNA 的濃度和純度就越高。⒊⒊ 幾種 PCR 體系的優(yōu)化由于 PCR 影響因素很多，獲得理想的擴增效果較難，有必要通過優(yōu)化系統(tǒng)建立最佳 PCR 擴增體系。設置退火溫度考慮了植酸酶基因的 GC 含量＞50%，退火溫度較高（60℃左右） 。Vitagene 試劑盒法方法簡單、步驟少，回收率高、質量好，大大減少了工作量。⒉⒋目的基因的回收純化結果用三種不同的方法回收 PhyA 目的基因片段，其中 PCR Fragment Recovery Kit 法回收的質量和數(shù)量最好，約 50ng/5μl，其它兩種方法回收數(shù)量無，如圖 3 所示：⒉⒌ 目的片段的酶切分析鑒定 結果見圖 4 所示。方法二：加熱溶解法 往凝膠塊中加水至凝膠的濃度降到 %以下；75℃水浴中溶解凝膠；然后按酚/氯仿抽提法回收。⒈⒉⒌ PCR 引物的設計 在 NCBI 基因文庫中下載黑曲霉植酸酶 phyA 的基因序列（Accession:AB022700、AE005804 、BD02363AB04280AF21881M94550 、Z16414 、L02421） ，比較他們基因序列的同源性；通過引物設計軟件篩選出兩對引物，引物 1 引入 KPnⅠ和HindⅢ酶切位點，引物 2 引入 KPnⅠ和 XbaⅠ酶切位點；同時用另一對已報道（姚斌等，含EcoRⅠ酶切位點）的引物 3 作對照，最后確定一對擴增效果最佳的引物。主要儀器：梯度 PCR 儀(German)、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)（ Italy） 、空氣恒溫震蕩器（HZQC ） 、電泳裝置( 北京)、冷凍離心機（universal 32r） 、超純水系統(tǒng) (Labconco)、霉菌培養(yǎng)箱（MJX250Ⅱ，廣東） 、微量移液器
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