質(zhì)粒dna的提取和鑒定(完整版)
【正文】 b之間，結(jié)構(gòu)簡單，大多是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA分子，通常以超螺旋狀態(tài)存在于許多細(xì)菌和酵母菌中。 ? 轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒 DNA仍能進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)拷貝。 質(zhì)粒 DNA的提取方法 堿裂解法基本原理 ? 葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部， EDTA是 Ca2+和 Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價(jià)金屬離子從而達(dá)到抑制 DNase的活性，避免質(zhì)粒被酶降解。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA分子：一般來說，其中閉環(huán)結(jié)構(gòu)泳動(dòng)最快，其次為線性結(jié)構(gòu)，最慢的可能是單鏈開環(huán)。 載體的酶切與載體的構(gòu)建 ? 本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒為酵母表達(dá)載體pPIC9多克隆位點(diǎn)中插入了不包含信號肽序列的 NGAL基因編碼區(qū)，該質(zhì)粒能轉(zhuǎn)化至酵母菌中，由 5′AOX1啟動(dòng) NGAL編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄后翻譯成蛋白，從而獲得大量的重組蛋白。l ）無水乙醇，混勻后，室溫放置 2 min； 12022 rpm 離心 5 min。l 充分混勻， 37 ℃ 水浴孵育 12h。 ? 可用生物軟件 Chromas查看測序結(jié)果，軟件 DNAMAN分析序列比對，觀看插入載體的外源片段是否與原基因序列一致。 2. 膠床準(zhǔn)備 ① 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有 1mm的間隙； ② 將膠床放在調(diào)整好的水平臺上； 3. 鋪膠：將冷卻致 60℃ 的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約 5 mm； 水平電泳系統(tǒng) 4. 室溫下靜置 1小時(shí)左右，凝膠固化。l TE 溶液，使 DNA完全溶解，短暫振蕩 5分鐘后即可酶切（或 20℃ 保存）。 NGAL 編碼區(qū) MCS Bgl II 一 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增 將微量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑單克隆于 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 DNA吸收 254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在 302nm和 366nm有光吸收。 SDS與 NaOH聯(lián)用，其目的是為了增強(qiáng) NaOH的強(qiáng)堿性，同時(shí) SDS能很好地結(jié)合蛋白，產(chǎn)生沉淀。 以應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的 pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)件 ? 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要是否將片段進(jìn)行表達(dá)，將載體分為表達(dá)載體和克隆載體。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間傳遞，其在胞內(nèi)的存在一般對宿主細(xì)胞的代謝活動(dòng)無影響。質(zhì)粒具有不相容性，兩種不同的質(zhì)粒不能共存在同一個(gè)宿主細(xì)胞中。 ? 5?AOX1 啟動(dòng)子片段含有 AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)； ? α因子信號肽序列為
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