植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交(完整版)
【正文】 觀察， 易添加培養(yǎng)基；不易污染等。 （一）液體淺層培養(yǎng) 方法 把原生質(zhì)體以一定的密度（ 約 2 105個 /mL）懸浮在液體淺層培養(yǎng)基中（淺層的厚度以 1mm為宜），用石蠟?zāi)し庾∑矫蠛?，放在適宜條件下培養(yǎng)。銨對許多植物（如煙草、馬鈴薯）的原生質(zhì)體有毒害作用，抑制原生質(zhì)體的生長。 （三）植物激素 不同植物原生質(zhì)體培養(yǎng)對激素的種類和濃度的要求 存在較大的差異 。較高水平的滲透壓雖可阻止原生質(zhì)體破裂，但影響細(xì)胞的代謝、分裂和生長。 四、滲透壓 離體原生質(zhì)體的一個基本屬性是它們的滲透破碎性。 三、酶處理 原生質(zhì)體分離在很大程度上取決于所用酶的性質(zhì)和濃度 ，因此要做好 酶種類、處理濃度的選擇 。 （ 1）茄科 一般選擇生長旺盛、生理狀態(tài)一致的剛展開的幼嫩葉片。 第二節(jié) 影響原生質(zhì)體產(chǎn)量 和活力的因素 一、材料來源 （一） 植物葉片 （二） 培養(yǎng)細(xì)胞 二、 預(yù)處理 三、 酶處理 四、 滲透壓 （一） 植物葉片 當(dāng)從植物葉片分離原生質(zhì)體時，植株的生長環(huán)境、植株年齡等對原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)影響較大。 注意： （ 1）整個過程用相同的滲透液，滲透壓以稍高于原生質(zhì)體內(nèi)滲透壓，細(xì)胞稍微發(fā)生質(zhì)壁分離為好。 Macerozyme R10 （ 2） 酶解分離原生質(zhì)體的方法 ① 兩步分離法 這種分離方法是先用果膠酶離析植物組織，使植物細(xì)胞從組織中分離出來，然后收集細(xì)胞經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁，最后獲得原生質(zhì)體。 第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化 一 、 原生質(zhì)體的分離 （一） 分離原生質(zhì)體的材料來源 （二） 分離方法 1．機械分離法 2．酶法分離 （三） 技術(shù)程序 二、 原生質(zhì)體的純化 （一）分離原生質(zhì)體的材料來源 游離原生質(zhì)體時 ， 植物葉片 、 花瓣 、 果實組織 、 子葉 、下胚軸 、 幼根 、 莖葉 、 愈傷組織 、 懸浮細(xì)胞等都可作為材料來源 ， 但常用于分離原生質(zhì)體的材料為： 葉片 葉片來源豐富 ， 供應(yīng)及時 ， 有明顯的葉綠體存在時也便于在細(xì)胞融合中識別 。 （ 3）不同來源的原生質(zhì)體具有 彼此融合 的能力。 （ 1）分離原生質(zhì)體的酶類 酶的類型 作用 常用種類 纖維素酶 降解細(xì)胞壁中纖維素成分，游離原生質(zhì)體。 活力檢測 原生質(zhì)體的培養(yǎng) 原生質(zhì)體 ?再生細(xì)胞壁 ?細(xì)胞分裂，形成愈傷組織 ?愈傷組織分化成苗 二、原生質(zhì)體的 純化 （一） 離心沉淀法 (過濾濃縮法） （二） 接口法 選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)速度離心后即介于兩種溶液之間。 優(yōu)劣 該法可收集較純的原生質(zhì)體，且原生質(zhì)體破碎較少。即： 頻繁繼代（每 2~3天繼代 1次）的懸浮培養(yǎng)物以及處于對數(shù)生長早期的細(xì)胞是最適宜的供體材料。 （ 2） 將葉、胚軸、嫩莖等切成小塊或薄片，投入到酶溶液中。 （ 2）對于葉片、子葉、下胚軸等材料 常用 Cellulase R10 、 Macerozyme R Hemicellulase等活性屬一般的酶，酶處理濃度可低些，用量少一些。 內(nèi)源細(xì)胞滲透壓明顯地受環(huán)境條件的影響 ， 并且能夠用暗處理植株和幼葉組織等措施加以控制 。 在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，一般常用的滲壓劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麥芽糖等。 （ 3）由活躍生長的培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體要求較高的生長素 /分裂素配比才能進行分裂； 由高度分化的細(xì)胞如葉肉細(xì)胞得到的原生質(zhì)體，常需要較高的分裂素 /生長素配比才能進行脫分化。 二、 培養(yǎng)方法 ?原生質(zhì)體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)的方法， 因為 ： （一） 液體淺層培養(yǎng) （二） 平板法培養(yǎng) （三） 懸滴法培養(yǎng) （四） 固液結(jié)合培養(yǎng)法 原生質(zhì)體培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng) 有些物種的原生質(zhì)體不能在固體培養(yǎng)基上分裂。 優(yōu)劣 ?有利于原生質(zhì)體均勻分布； ?便于定點觀察，可跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生、分裂等行為； ?也有利于在部分材料污染時搶救未污染的部分。 瓊脂糖珠培養(yǎng)法 即將原生質(zhì)體與瓊脂糖培養(yǎng)基混合后，逐滴滴在培養(yǎng)皿底面，待其凝固后，再在其周圍加入液體培養(yǎng)基。 在原生質(zhì)體對光敏感的情況下，應(yīng)盡量減少觀察的次數(shù)，凡經(jīng)觀察過的原生質(zhì)體不應(yīng)包括
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