【正文】 于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，細胞總數(shù)不斷增加，產(chǎn)量達最高點后生長趨于停止，然后進行移植繼代培養(yǎng) 方法 （ 4） 細胞懸浮培養(yǎng)法 單細胞懸浮 105~ 105細胞 /ml, ? 干燥保存法、 ? 液體石蠟覆蓋法、 ? 低溫保存法 ? 低壓低氧保存法 ? 超低溫深凍保存法 七、 種質(zhì)保存 ? 超低溫深凍保存法 ? 材料 ：愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞、原生質(zhì)體、花粉、花粉胚、體細胞胚狀體、莖尖分生組織、小植株及莖芽 ? 196℃ 液氮 ? 冰凍保護劑 二甲亞砜（ DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等， ? 復(fù)合 成分較單一成分效果 佳 ， ? 5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高 10倍左右。每 1L培養(yǎng)基，可分裝 20～ 30瓶。 移液 取燒杯一只，加入少量的蒸餾水，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于燒杯中備用。以后者效果好。 在配制鐵鹽時 ， 如果加熱攪拌時間過短 ， 會造成 Fe S 04和 Na2EDTA鰲合不徹底 ， 此時若將其冷藏 ， Fe S 04會結(jié)晶析出 。5H2O、 CoCl2特別應(yīng)將 Ca2+、 SO42一 、 Mg 2十 和 H2PO4一 等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。 ?MS培養(yǎng)基 是目前應(yīng)用最多最 普遍 的培養(yǎng)基。增加細胞鮮重、干重及 RNA酶活性，蛋白質(zhì)合成能力完全減退； ?穩(wěn)定期 ： 細胞數(shù)穩(wěn)定。 第二節(jié) 植物 細胞培養(yǎng)特性 及主要 培養(yǎng)技術(shù) ?細胞的全能性 : 一個細胞具有產(chǎn)生完整生物個體的固有能力。 ? 19371938年， Nobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得 愈傷組織 。 第四章 植物細胞工程 Plant Cell Engineering 第一節(jié) 概述 掌握 植物細胞工程 基本概念 及其主要內(nèi)容 應(yīng)用 了解 植物細胞工程的研究簡史、現(xiàn)狀 及發(fā)展前景 熱點 植物細胞工程的發(fā)展歷史 德國植物學(xué)家 Haberlandt 植物細胞培養(yǎng)創(chuàng)始人 ? 1902年根據(jù)細胞學(xué)說 （ cell theory ）提出植物體細胞有再生完整植株的潛在全能性 細胞全能性 （ totipotency） 植物細胞全能性是植物細胞工程的理論基礎(chǔ) 1904年，德國植物胚胎學(xué)家 Hanning 用蘿卜和辣根的胚進行離體培養(yǎng)，提早長成了小植株，首次獲得胚培養(yǎng)成功。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細胞增殖，形成愈傷組織。 一、重要概念 ?植物干細胞 ：植物 胚性細胞 （ embryogenic cells）即合子。細胞高液泡化，極度脆弱，高度分化及高濃度有機化合物。 無機鹽的濃度較高 ，能保證組織培養(yǎng)生長所需的礦物營養(yǎng)。 (2)CaCl26H2O ，因此在配制中分微量 Ⅰ 、 Ⅱ 配制。 為避免此現(xiàn)象發(fā)生 ， 配制鐵鹽母液時 ， Fe S 04和 Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合 ，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色 (約加熱 20 30 min)， 調(diào) pH值至 5 .5， 室溫放置冷卻后 ，再冷藏 。 （２）細胞分裂素，例如 KT，應(yīng)先用少量 95%乙醇或無水乙醇加 3~4滴 1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/L HCl溶解，再用蒸餾水定容。 稱取瓊脂蔗糖備用 融化 用量杯量取 600～ 700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。 包扎 用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。 七、 種質(zhì)保存 第三節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng) 和融合技術(shù) ?指除去細胞壁的細胞或一個被質(zhì)膜所包圍的且具有生活力的裸露細胞。 ? FDA法： FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細胞質(zhì)膜，在 活細胞內(nèi)， FDA被酯酶裂解即 發(fā)熒光 （熒光素），熒光素不能自由通過質(zhì)膜。 細胞學(xué)鑒定 ：細胞器鑒定、染色體鑒定。 ? 基因槍法 、 電激法 、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 、 碳化硅纖維介導(dǎo)法和花粉管通道法等 。 ? 5． 直接分化芽受體系統(tǒng) 由未分化的細胞直接分化形成 ，穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)化頻率最低 受體系統(tǒng) 1 基因水平的檢測 ， 限制性內(nèi)切酶分析 、 DNA序列分析 、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、 Southern blot分析 、 Northern blot分析 、 原位雜交 六 轉(zhuǎn)入基因表達 分析 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) Western雜交 βD葡糖醛酸糖苷酶的組織化學(xué)定位分析 、 βD葡糖醛酸糖苷酶的熒光分