細(xì)胞生物學(xué)研究方法(3)(完整版)
【正文】 儀 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù) ? 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法 （ histochemical and cytochemical staining method） 用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究 。 電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系 ， 將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像 ， 即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài) 。 然后斷開 ， 升溫后 ， 冰升華 ，暴露出了斷面結(jié)構(gòu) 。 ? 由電子照明系統(tǒng) 、 電磁透鏡成像系統(tǒng) 、 真空系統(tǒng) 、 記錄系統(tǒng) 、 電源系統(tǒng)等 5部分構(gòu)成 。 ? 載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn) 。 ? 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。 – sin α /2的最大值必然小于 1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為 ~；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近 。 — 、光學(xué)顯微鏡 ? 1. 構(gòu)成： ? ①照明系統(tǒng) ? ②光學(xué)放大系統(tǒng) ? ③機(jī)械裝置 ? 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。 （三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM P53 ? 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 2. 相位板 （ annular phaseplate） ：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板 ， 可將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。 ? 自動(dòng)化與電子化 。 2）負(fù)染技術(shù) P60 ? 用重金屬鹽 (如磷鎢酸 )對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)。 （二）掃描電子顯微鏡 SEM P62 Scanning electron microscope（ SEM） ? 工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 ? 顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植 、 顯微注射 、 嵌合體技術(shù) 、胚胎移植以及顯微切割等 。 2. Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使 Schiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色 。 ? 免疫熒光法 （ immunofluorescent technique） ：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 、 羅丹明等 。 – 14C半衰期為 5730年 ， 3H為 。 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù) 一、離心技術(shù) ? 是分離細(xì)胞器 （ 如細(xì)胞核 、 線粒體 、 高爾基體 ） 及各種大分子基本手段 。 Low speed High speed Differential centrifugation （二）密度梯度離心 ? 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度 ， 將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部 ， 通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層 、 分離 。 ? 特點(diǎn)： ? 介質(zhì)密度較高 ， 陡度大 ， 介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度 。 ? 細(xì)胞株 （ cell strain） ：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群 。 4. 單倍體培養(yǎng)：通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。 于是英國(guó)人 Kohler和 Milstein 1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù) ， 獲 1984年諾貝爾獎(jiǎng) 。 ? 同核體： 相同基因型的細(xì)胞融合而成 。 ? 克隆 （ clone） ：亦稱無(wú)性系 。 ? 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處 ， 并停留在那里達(dá)到平衡 ， 從而將不同密度的成分分離 。 ? 常用介質(zhì)：氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 ? 轉(zhuǎn)速 25kr/mi
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