目的基因的獲取ppt課件(完整版)
【正文】 RTGSP 變性、退火 5‘ AAAAAA3’ 3’ 5’ GSP 3’ 5’ 5’ 3’ ? 已知目的基因編碼的蛋白 N端部分氨基酸序列信息，可以以此設(shè)計(jì)特異引物，從總 RNA中獲得目的基因。 pUC18/19是 —— 載體。 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象涉及到的兩種酶是 和 。 化學(xué)合成的單元操作 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 縮合 氧化 脫取代基 可控微孔玻璃珠 CPG 連接臂 五、基因的組裝 目前合成能力 200b以內(nèi)，若要合成更長(zhǎng)的基因，則需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，稱為基因的組裝。 第三節(jié) 篩選基因文庫(kù)獲取目的基因 一、基因組文庫(kù)的構(gòu)建 二、 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 三、篩選基因文庫(kù)獲取目的基因 ? 基因文庫(kù)（ gene library） 通過(guò)克隆的方法將某一基因組 DNA或 cDNA保存于適當(dāng)宿主菌或噬菌體中形成轉(zhuǎn)化子群，所有重組 DNA序列總和代表該基因組的 DNA全部或部分序列。 ： ? 長(zhǎng)度小 , 操作方便； ? 便于篩選某一特定功能的基因； ? 利于獲得較多的模板； ? 可在原核細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的蛋白； ? 不同種類不同狀態(tài)的細(xì)胞的 cDNA文庫(kù)不同； ? 不能研究基因組的結(jié)構(gòu)功能； 3. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程 1） mRNA的提取與純化 ?提?。哼x用目的基因 mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來(lái)源； ?純化：將提取的 mRNA在寡聚脫氧胸苷酸纖維素中進(jìn)行親和層析。是一種快速有效的克隆差異性表達(dá)基因的方法。 mRNA: 5’N‘M’AAAAAA… AA3’(12種序列 ) 3’NMTTTTTTT… TT5’ 5’隨機(jī)引物 ： 10mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的 mRNA。 思考題： 試述構(gòu)建基因文庫(kù)的原理和步驟 ? 。 第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因 ?有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。 3 ’錨定引物： 12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄 mRNA，合成第一鏈 cDNA。 mDNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs 3） cDNA第二條鏈的合成 ?自身引物法 ?置換合成法 ?引導(dǎo)合成法 cDNA第二鏈的合成（ 自身引物法） 煮沸 NaOH AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTT
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1