【正文】 按①操作。將分層后 的氯仿放入已備好的具有無(wú)水硫酸鈉的漏斗中，過(guò)濾，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分層后一并濾于同一蒸發(fā)皿中，最后用少量氯仿洗滌濾器，洗液并入以上蒸發(fā)皿中。 ： 5％次氯酸鈉溶液，取 100克漂粉精，加入 500 毫升水，攪勻，另溶解 70 克碳酸鈉（ Na2Co H2O）于 500 毫升溫水中，溶后，倒入上述溶液中攪勻、澄清、過(guò)濾、備用。 d. 質(zhì)譜法 采用組分質(zhì)譜圖中的特征離子峰可進(jìn)行定量。如果在分離機(jī)理不同的色譜體系中，比較 Rf 值仍能得到肯定的結(jié)果，那么其可靠性將更大。 五 薄層色譜掃描儀 （一）儀器結(jié)構(gòu) TLC 掃描儀結(jié)構(gòu)主要包括光學(xué)元件組合系統(tǒng)、電子元件組合系統(tǒng)及機(jī)械元件組合系統(tǒng)。溶劑極易揮發(fā)，流動(dòng)相組成隨時(shí)改變。這一過(guò)程需在具有一定形狀的展開室中進(jìn)行。不同種類的 樣品 常需選用不同的配樣溶 劑，一般采用易揮發(fā)的非極性或弱極性溶劑配樣。 （ 3）粘合劑 在制備薄層板時(shí)，一般需在吸附劑中加入適量粘合劑，其目的是使吸附劑顆粒之間相互粘附并使吸附劑薄層緊密的附著在載板上。被展開的組分斑點(diǎn)即色譜譜帶，通過(guò)適當(dāng)技術(shù)對(duì)色譜譜帶進(jìn)行處理可得到定性和定量的檢測(cè)結(jié)果。 薄層色譜法具有技術(shù)比較簡(jiǎn)單，操作容易，分析速度快，高分辨能力，結(jié)果直觀，不需 昂貴儀器設(shè)備就可以分離較復(fù)雜混合物等特點(diǎn)。常用的粘合劑可分為無(wú)機(jī)粘合劑和有機(jī)粘合劑兩類。離子型化合物樣品， 常需先衍生化成在揮發(fā)性強(qiáng)、極性小的溶劑中易溶解的樣品衍生物。薄層展開 有 三種形式，直線式展開方式為實(shí)際應(yīng)用中使用最普遍的展開方式。 （二）幾種常用薄層色譜分離模式的展開機(jī)制 在 TLC分離中，液固展開是一種最經(jīng)典的展開方式。 （ 二 ） 主要功能 薄層色譜掃描儀主要用于 TLC 圖被分離斑點(diǎn)和薄層空白的光學(xué)相應(yīng)信號(hào)測(cè) 量。 板上化學(xué)反應(yīng)定性主要有以下兩種方式： a. 反應(yīng)后生成特征顏色的化合物，借以鑒 定反應(yīng)物； b. 反應(yīng)后生成復(fù)雜的、無(wú)法鑒定組分的混和物，但可根據(jù)生成物的“指紋” 特征加以鑒定； c. 除以上兩種定性反方法外，還有板上光譜定性、 TLC 與其他聯(lián)用技術(shù)間 接聯(lián)用定性、薄層色譜－傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用定性以及薄層色譜－質(zhì)譜聯(lián)用定性。 a. 斑點(diǎn)面積測(cè)量法 以半透明紙掃下 TLC 圖上的斑點(diǎn)界限，然后測(cè)量其面 積。 ①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（ 微克 /毫升）： GBW(E)090015嚴(yán)格控制、應(yīng)加鎖于冰箱中避光存放。將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥內(nèi)于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在水浴上冷卻 2－ 3 分鐘，準(zhǔn)確加入苯乙腈 1 毫升。 ③適用于醬油、醋，方法有二： 第一法：稱取樣品 10 克于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加氯化鈉 4 克，移于分液漏斗中，燒杯用氯仿15 毫升分次洗滌，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振搖 2 分鐘，靜止分層后按第①操作。以下按①操作。 第四 點(diǎn)：樣液 20 微升加黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)液（ 微克 /毫升） 10 微升。 再展開同前，在紫外燈光下，觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素 B1相同的衍生物，未加三氟乙酸與 4 兩第二部分 色譜分析 6 點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。先進(jìn)行橫展，在展開槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加無(wú)水乙醚 10 毫升，將點(diǎn)好的板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于層析槽內(nèi)展開，展至板端后繼續(xù)展開 1 分鐘，取出揮干 再進(jìn)行縱展。再用雙向展開法，展開后，觀察樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的產(chǎn)物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物后的板。滴加以下二板，距左邊緣 厘米處第四板滴加樣液 20 微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加樣液 20 微升，黃曲霉毒素 B1標(biāo) 準(zhǔn)液（ 微克/毫升） 10 微升及三氟醋酸一小滴，產(chǎn)生衍生物的步驟同單向展開法，再用雙向展開法展開后，將以上兩板在此外光燈下觀察，以確定樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。 ②對(duì)局部霉變樣，應(yīng)單獨(dú)取樣檢驗(yàn)。 （ 7）在具體測(cè)定條件下，有時(shí)用無(wú)水乙醚作薄層板的橫展后，標(biāo)準(zhǔn) B1點(diǎn)仍有稍微移動(dòng)，這并不影響測(cè)定結(jié)果。色譜柱主要分為兩種類型，填充柱與毛細(xì)管柱，其內(nèi)均填充具有一定特性的固定相物質(zhì)。隨著載氣的流動(dòng)，被測(cè)組分在吸附劑表面進(jìn)行反復(fù)的吸附洗脫。 b 基線漂移 指基線隨時(shí)間定向的 緩慢變化。 r12= t’R2/t’R1 3 色譜峰區(qū)域?qū)挾? 色譜 流出 曲線中一個(gè)重要參數(shù) .從色譜分離角度看 ,希望區(qū)域?qū)挾仍秸胶?.通常度量色譜峰區(qū)域?qū)挾扔袃煞N方法： a 半峰寬度 (Wh/2) 又稱半寬度或區(qū)域?qū)挾?,即峰高一半處的寬度。常用的載氣有氫氣、氮?dú)?、氬氣、氦氣、二氧化? 氣等等。 ２、液體試樣：一般用微量注射器進(jìn)樣，方法簡(jiǎn)便，進(jìn)樣迅速。選擇柱溫的根據(jù)是混合物的沸點(diǎn)范第二部分 色譜分析 10 圍，固定液的配比和鑒定器的靈敏度。當(dāng)用同等長(zhǎng)度的柱子，顆粒細(xì)的分離效率就要比粗的好些。對(duì)于常規(guī)分析，液體進(jìn)樣量為１－２０微升；氣體進(jìn)樣量為０ .１－５毫升。完全滿足上述要求的擔(dān)體是困難的，人們?cè)趯?shí)踐中只能找出性能比較優(yōu)良的擔(dān)體。 （５）活性炭：可以單獨(dú)做為固定相。 ３、硅烷化：用硅烷化試劑和擔(dān)體表面的硅醇、硅醚基團(tuán)起反應(yīng)，除去 表面的氫鍵結(jié)合能力，可以改進(jìn)擔(dān)體的性能。 （十一）常用的擔(dān)體目數(shù) 常用的４－６毫米內(nèi)徑的色譜柱：對(duì)于較長(zhǎng)色譜柱，選用擔(dān)體目數(shù)一般 為４０－８０目；對(duì)于較短色譜柱選用擔(dān)體目數(shù)一般為８０－１００目 (每英寸內(nèi)的篩孔數(shù)目為目 )。 微量分析要用硅烷化的擔(dān)體。采用化學(xué)鍵合固定相分析極性或非極性物質(zhì)通常都能夠得到對(duì)稱峰，柱效很高，固定相的熱穩(wěn)定性也有所改善。這時(shí)樣品各組分與固定液分子間作用力主要是定向力和誘導(dǎo)力，各組分出峰次序按極性順序，極性小的先出峰，極性 越大，出峰越慢； b、分離非極性化合物，應(yīng)用非極性固定液，樣品各組分與固定液分子間作用力是色散力，沒(méi)有特殊選擇性，這時(shí)各組分按沸點(diǎn)順序出峰，沸點(diǎn)低的先出峰。所以 應(yīng)控制 它與擔(dān)體的重量比例，低比例為５％，一般用１５％第二部分 色譜分析 13 －２５％。裝好后，塞上玻璃棉。電子捕獲檢測(cè)器對(duì)于負(fù)電及較強(qiáng)的化合物具有極高的靈敏度，利用這一特點(diǎn)，可分別測(cè)出痕量的六六六、滴滴涕。加石油醚30mL，再振蕩 30min，靜止分層。 氣相色譜測(cè)定 填充柱氣相色譜條件：色譜柱：內(nèi)徑 3mm，長(zhǎng) 2m的玻璃柱，內(nèi)裝涂以 %OV17 和 2%QF1 混合固定液的 80 目 100 目硅藻土。 色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（ Tswett）在1906 年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。色譜柱每米降壓為 75 Kg/cm2 以上。 柱子可反復(fù)使用 —— 用一根色譜柱可分離不同的化合物。） 按 操作形式 可分為紙色譜法 (PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。分離過(guò)程是一個(gè) 分配平衡 過(guò)程 。適用于分離非極性和極性 較弱的化合物。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子 與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行 可逆交換 ，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分 排阻能力 的差異而完成分離。 相對(duì)保留時(shí)間（ tR＇）： tR － tM 。與物質(zhì)的分配平衡有關(guān)的問(wèn)題就屬于色譜熱力學(xué)的范疇。如果保持峰寬不變，加大峰間距，則色譜峰的重疊程度減小，分離得到改善；如果保持峰間距不變，而使峰的寬度減小，同樣可以使色譜峰的重疊程度減小，分離得到改善。 2） 樣品加在第 0 號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。一般可以采取以下措施來(lái)改變選擇性： a. 改變流動(dòng)相的組成及 pH 值； b. 改變柱溫；c. 改變固定相。 后來(lái) Giddings和 Snyder等人在 Van Deemter方程（ H＝ A＋ B/u＋ Cu，亦稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即 Giddings 方程）： H＝ A＋ B/u＋（ Cm＋ Cs） u 其中 Cm 為流 動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)， Cs 為固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)。毛細(xì)管無(wú)填料， A＝ 0。 γ 是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能 自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm 進(jìn)行校正?？拷畛漕w粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來(lái)得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。高柱溫可以增大 Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。過(guò)高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。其次，希望將樣品直 接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。 第二部分 色譜分析 20 下面對(duì)液相色譜儀的主要組成部分的構(gòu)造、性能及使用中的注意事項(xiàng)作一簡(jiǎn)單介紹。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和 分析結(jié)果的可靠性。由于 HPLC 的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（ N 越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。以 H 對(duì) u 作圖，則有一最佳線速度 uopt，在此線速度時(shí)， H 最小。在分配色譜中 Hs 與 df 的平方成正比，在吸附色譜中 Hs 與吸附和解吸速度成反比。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。 ③ 傳質(zhì)阻抗（ mass transfer resistance）。又稱縱向擴(kuò)散。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來(lái)實(shí)現(xiàn)。 4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。分配在固定相中的分子不能隨流動(dòng)相通過(guò)柱子。 線流速（ u）：非保留溶質(zhì)在色譜柱中的線速度 u=L/ tM 。 第二節(jié) 基本概念和理論 一、基本概念和術(shù)語(yǔ) 下面介紹一下 HPLC 中常用的術(shù)語(yǔ)及符號(hào)： 容量因子（ k＇）：表示某一溶質(zhì)在色譜柱中任意位置達(dá)到平衡后，該溶質(zhì)在固定相中的量與在流動(dòng)相中的量之比。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的 pH 值和離子強(qiáng)度影響。 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍還在逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很第二部分 色譜分析 16 少采用。 1． 液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。 三、液相色譜法分類 如同人們認(rèn)識(shí)許多事物一樣，對(duì)研究的對(duì)象分類，有助于人們更深入的認(rèn)識(shí)這一事物。 高效 —— 可達(dá)數(shù)萬(wàn)甚至十萬(wàn)塔板每米。 液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、 時(shí)間長(zhǎng) （常有幾個(gè)小時(shí)） 。進(jìn)樣量為 1uL10uL。取上清夜進(jìn)行 GC 分析。 2 試劑 以下未注明級(jí)別的試劑，均為分析純。 （廿一）新裝填的色譜柱老化 裝填好的色譜柱，連接于儀器上后，應(yīng)先試壓，試漏，而后在恒定的溫度下用載氣吹洗數(shù)小時(shí) 至數(shù)十小時(shí)后 方可用于 分析，一般 稱此為柱子的老化過(guò)程。由于低比例能促進(jìn)平衡的建立，可以用較高的載氣流速，所以用低的液體比例，再加上少量樣品，能縮短分析時(shí)間。如醇、酚、胺和水的分離，一般選擇極性或氫鍵型的固定液，這時(shí)依組分和固定液分子間形成氫鍵能力大小進(jìn)行分離。對(duì)氣相色譜用的固定液，一般有如下幾點(diǎn)要求： １、在操 作溫度下蒸氣壓低，熱穩(wěn)定性好，與被分析物理或載氣不產(chǎn)生不可逆反應(yīng)； ２、在操作溫度下呈液態(tài)，而且粘度愈低愈好。但是在普通的常量分析中，對(duì)擔(dān)體可以不必過(guò)份講究，甚至如耐火磚粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。在常用硅藻土擔(dān)體中 : 紅色擔(dān)體（如６２０１、２０１），可用于非極性或弱極性物質(zhì)的分離。 ４、釉化：把欲處理的擔(dān)體在２、３％的碳酸鈉－碳酸鉀（１：１）水溶液中浸泡一天，烘干后先在８７０度下煅燒３、５小時(shí)，然后升溫到９８０度煅燒約４０分鐘。 （九）常用的擔(dān)體 １０１擔(dān)體：為白色硅藻土擔(dān)體； １０２擔(dān)體：為白色硅藻土擔(dān)體； celite545：為白色硅藻土擔(dān)體； ２０１擔(dān)體：為紅色硅藻土擔(dān)體； ６２０１擔(dān)體：為紅色硅藻土擔(dān)體； Ｃ－２２保溫磚：為紅色硅藻土擔(dān)體； chromosorb：為紅色硅藻土擔(dān)體。 １、硅藻土類型： （１）白色的：表面積小，疏松，質(zhì)脆，吸 附性能小，經(jīng)適當(dāng)處理，可分析強(qiáng)極性組分； （２）紅色的：有較大的表面積和較好的機(jī)械強(qiáng)度，但吸附性較大。 ２、要易于加工成型。比例過(guò)大有損于分離，比 例過(guò)小會(huì)使色譜峰拖尾。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點(diǎn)的柱溫為較合適，對(duì)易揮發(fā)樣用低柱溫，不