【正文】 為陽(yáng)離子脂質(zhì)靠靜電作用與核苷酸結(jié)合，而 DOPE 則作為可融性脂質(zhì)促進(jìn)陽(yáng)離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜的融合。按脂質(zhì)體的大小和脂質(zhì)雙層數(shù)目可將納米脂質(zhì)體分為以下幾類： 小單層納米脂質(zhì)體（ small unilamellar vesicles， SUVs）： SUVs 是具有脂質(zhì)雙分子層的最小單位，其大小根據(jù)介質(zhì)的離子強(qiáng)度和膜的脂質(zhì)組成不同而不同，一般在 20 nm~100 nm 之間。由 SA 和 DOPE 按質(zhì)量比 1:1 制備的脂質(zhì)體是目前已知的完全由天然脂質(zhì)體所構(gòu)成的陽(yáng)離子 納米脂質(zhì)體，它對(duì)機(jī)體的免疫原性小，可能今后會(huì)在基因治療上得到較好的應(yīng)用。 脂質(zhì)融合是指當(dāng)兩種不同形態(tài)的脂質(zhì)混合時(shí)，兩種脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)發(fā)生復(fù)合形成新的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的過(guò)程。由于空間位阻的原因，含有小極性頭部基團(tuán)（如磷酯酰乙醇胺， PE）的脂質(zhì)比含有大極性頭部基團(tuán)的 脂質(zhì)更易形成六方晶相的構(gòu)型。當(dāng)開始加入的脂質(zhì)體的量較低時(shí)，陽(yáng)離子納 米脂質(zhì)體結(jié)合在 DNA 分子表面形成聚集的囊泡；當(dāng)連續(xù)加入陽(yáng)離子脂質(zhì)體使其濃度達(dá)到臨界脂質(zhì)濃度時(shí)， DNA 誘導(dǎo)的納米脂質(zhì)體融合和納米脂質(zhì)體引起的 DNA 壓縮開始發(fā)生，最終形成了陽(yáng)離子脂質(zhì)雙層包裹的 DNA復(fù)合物。 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物呈現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)可能多種多樣，也不能排除幾種結(jié)構(gòu)同時(shí)存在的情況。一般認(rèn)為，納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物帶有過(guò)量正電荷對(duì)轉(zhuǎn)染很關(guān)鍵，可增強(qiáng)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的結(jié)合 10 力 ，使進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)合物的量增加。而當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)與 DNA 的正負(fù)電荷比為 1 時(shí)，此時(shí)復(fù)合物呈電中性，其平均粒徑在 350nm~1200nm 范圍內(nèi)。 此外，陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體與 DNA 溶液的混合速度和方式對(duì)陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的形成有很大的影響。由此可見，納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物在細(xì)胞外基質(zhì)中易受各種離子和大 分子物質(zhì)的影響，使其穩(wěn)定性大大下降。 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物靜脈注射后能迅速被循環(huán)系統(tǒng)清除，在肺中蓄積和表達(dá)，而在肝臟中表達(dá)的較少。盡管如此，膜融合在基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用還是不容忽視的。通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物必須與內(nèi)涵體融合，才能將DNA 釋放出來(lái)。 (3) DNA 向核周圍的轉(zhuǎn)運(yùn) 當(dāng)陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物從內(nèi)涵體中脫離以后，如何將 DNA 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核周圍成為一個(gè)新問(wèn)題。有人認(rèn)為，納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，可能會(huì)導(dǎo)致 DNA 的釋放發(fā)生在 不同的階段。對(duì)處于有絲分裂期的細(xì)胞而言，由于核膜已經(jīng)破裂，質(zhì)粒 DNA 容易進(jìn)入核內(nèi)；對(duì)于非分裂期細(xì)胞而言，核膜保持完整，質(zhì)粒 DNA 能否進(jìn)入核內(nèi)是轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵。用免疫化學(xué)方法在 5 例病人瘤組織中均檢測(cè)到 HLA B7 蛋白的表達(dá)，且能檢測(cè)到機(jī)體對(duì) HLA B7 的免疫應(yīng)答。該研究表明了 DCCholE1A 復(fù)合物腔內(nèi)注射給藥的有效性，同時(shí)也為 E1A 基因的Ⅱ期臨床提供了可行性保證。近年來(lái)，用陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體介導(dǎo)CFTR cDNA 在動(dòng)物或 人呼吸道和肺部轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)陸續(xù)開展，大部分接受了陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 CFTR cDNA 復(fù)合物的個(gè)體體內(nèi)都能檢測(cè)到 CFTR 基因的表達(dá)，部分恢復(fù)了氯離子通道的活力，陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體如 DOTAP/DOPE、 DCChol/DOPE 等都有成功報(bào)道 [51]。 在防止肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)方面， Zhou 等 [56]將陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體與中性粒細(xì)胞抑制因子（ NIF）基因的復(fù)合物轉(zhuǎn)入鼠體內(nèi)，研究了體內(nèi) NIF 表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺多形核中性粒細(xì)胞（ PMN）的分離及肺損傷發(fā)展的影響。例如，可根據(jù)需要在聚合物分子上耦聯(lián)細(xì)胞 （或組織）特異靶向組分，或應(yīng)用各種修飾方式改變其生理和理化性質(zhì)。該 納米 復(fù)合物電鏡下觀察顯示 [61]，多數(shù)質(zhì)粒 DNA 分子濃縮為孤立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)， DNA 的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但一級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)變化，仍保留轉(zhuǎn)錄活性 。這些結(jié)構(gòu)參數(shù) 包括聚合物 側(cè) 鏈的長(zhǎng)度、電荷 類 型（ 伯 胺型、 仲 胺型或 叔 胺型）、聚合物相對(duì)分子質(zhì)量、沿聚合物主鏈的電 荷 密度等。吞噬作用的速度由作用底物的理化性質(zhì)決定 ， 底物 的形狀 、親水性和表面 Zeta 電 位 的大小都對(duì) 納米復(fù)合物粒子 在體內(nèi)的循環(huán) 穩(wěn)定 性有一定的 影響 。為達(dá)到靶向性，可在陽(yáng)離子聚合物分子上結(jié)合多種靶向配基，形成配基 聚陽(yáng)離子耦合物。聚氨基酸作為生物材料具有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn) [69]： (1)由多種氨基酸可制備得到一系列均聚物和共聚物，主鏈兩側(cè) 胺基或羧基提供化學(xué)結(jié)合的位點(diǎn)； （ 2）聚氨基酸材料進(jìn)入生物體內(nèi)后，主鏈 裂解釋放出天然氨基酸組分，降解產(chǎn)物無(wú)毒或低毒，無(wú)刺激性。為了解決這些問(wèn)題，可在聚賴氨酸上連接一些配體和一些親水聚合物以促進(jìn)細(xì)胞的吸收， 并 降低毒性。因此人們對(duì)以前的 DNA/PLLLigand 模式加以改進(jìn)， 在 PLL/DNA 復(fù)合物表面 , 再連接 PEG 形成的復(fù)合物 ,提出了 DNA/PLL親水聚合物 Ligand 模式，既提高了體內(nèi)的穩(wěn)定性又提高轉(zhuǎn)染效率。正是由于 PLL 與 PLO 結(jié)合 DNA 的能力的不同，及其與 DNA 形成的納米復(fù)合物的穩(wěn)定性的差異，對(duì) pDNA 分子的細(xì)胞的和亞細(xì)胞的生理過(guò)程造成一定的影響，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率 ，以 PLO為基礎(chǔ)的基因載體的轉(zhuǎn)染效率較 PLL 提高了 10％。 殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量常在幾十萬(wàn)左右，在適當(dāng)條件下經(jīng)酶降解、無(wú)機(jī)酸降解和氧化 21 降解等，可獲得相對(duì)分子質(zhì)量較低的水溶性產(chǎn)物 （見圖 74） 。 Mao 等 [79]考察了影響殼聚糖 /DNA 復(fù)合物納米粒子的粒徑大小的幾種參數(shù)。當(dāng) pH 時(shí) ,殼聚糖分子中高密度的氨基 被質(zhì)子化而溶 于 水，離子表面的 Zeta 電位為 +12~ +18mv。 與殼聚糖分子上的游離氨基反應(yīng)可以制得一些它得衍生物。 pKa 可以大致反映 PEI 的質(zhì) 23 子化能力。 PEI/DNA 復(fù)合物表面 Zeta 電位可達(dá)﹢ 35mv，存在較多的正電荷，正電荷中和細(xì)胞表面的負(fù)性基團(tuán)， 具有一定的細(xì)胞毒性，進(jìn)入體內(nèi)易與血漿蛋白相互作用，從而引起復(fù)合物的去穩(wěn)定性、非特異性清除，導(dǎo)致毒副作用 [98]。 由于 PEI 在低于生理 pH 下具有相當(dāng)?shù)木彌_能力。 Jonathan等 [105]設(shè)計(jì)了一類陽(yáng)離子聚合物載體，旨在優(yōu)化直接影響陽(yáng)離子聚合物載體的轉(zhuǎn)染效率的因素，該復(fù)合物是葉酸、 PEI、和 PEG的接枝共聚物，與基因 pLuc 形成復(fù)合物 folate–PEG–folategraftPEI/pLuc（ FPFgPEI/DNA） ,該復(fù)合物具有突破內(nèi)涵體膜的能力，在轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞 KB、結(jié)腸 CT26 colon adenocarcinoma、肌肉平滑肌細(xì)胞（ SMC）時(shí)，轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞類型， FPFgPEG與 DNA形成電中性納米復(fù)合物時(shí)， MTT分析顯示無(wú)毒，轉(zhuǎn)染效率隨復(fù)合物的濃度的增高而升高，形成正電聚合物時(shí)，轉(zhuǎn)染效率隨復(fù)合物的濃度的降低而有所下降。其合成方法有兩種 [110,111]，如圖 76： ① 發(fā)散法（ divergent synthesis method） 它以一個(gè) ABn型（通常 n=2， 3）分子如氨、 1,2乙二胺（ EDA）、丙二胺或氯代苯三甲酸為核心啟始分子，經(jīng)重復(fù)的逐級(jí)聚合反應(yīng)，向四周徑向生長(zhǎng)、加層，最終形成樹枝狀結(jié)構(gòu)。增加 Dendrimer/DNA的 N/P 比值在溶液中將形成水溶性不同的不同密度的納米復(fù)合物，電荷密度隨著代數(shù)的增加而增大。 DNA 必須從內(nèi)涵體中脫離出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核才能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，否則將隨著內(nèi)含體進(jìn)入溶酶體而被溶酶體中的核酸酶降解。復(fù)合物對(duì)限制性內(nèi)切酶也很穩(wěn)定，這就使得 DNA在體內(nèi)存活時(shí)間延長(zhǎng)。其次，PAMAM樹狀大分子能緩沖內(nèi)體中的 pH值。 Hong 等 [120]研究發(fā)現(xiàn)，表面帶正電的樹狀大分子會(huì)在胞膜上形成瞬時(shí) 15–40 nm 的小孔，這些孔沒(méi)有選擇性，樹狀大分子可以由此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)， 27 胞內(nèi)物質(zhì)也可能由此出胞。 此外 ， DNA 濃度決定了所形成復(fù)合物形式：當(dāng) DNA 濃度 ≤10ng/mol時(shí)，其與 PMAMAD 形成復(fù)合物懸浮于水 溶液，無(wú)沉淀生成。 ② 會(huì) 聚法（ convergent synthesis method） 它主要涉及兩個(gè)步驟：首先，一系列小分枝反復(fù) 偶合 ，生成兩端具有活性基團(tuán)的樹枝狀結(jié)構(gòu)（ dendron） ， 然后錨定一個(gè)核心分子 ，從而產(chǎn)生一個(gè)由多個(gè) dendron 組成的高度 支 化的樹狀高聚物。 樹枝狀 大分子 （ dendrimers） 大量的末端官能團(tuán)、緊密且精確控制的分子結(jié)構(gòu)是樹狀大分子所具有的獨(dú)特性質(zhì)，這些特性使其越來(lái)越多的被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而應(yīng)用最活躍的一個(gè)領(lǐng)域是作為非病毒類基因載體。因此， PEI/DNA 不需要添加破膜劑 (disruption agents),即可有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞 [103]。通過(guò)耦聯(lián)負(fù)電性蛋白如轉(zhuǎn)鐵蛋白，增加 PEI 在復(fù)合物中的密度，可以獲得 Zeta 電位近于中性的納米復(fù)合物。 支 鏈 型 PEI 中 伯 胺 的 N 占 25% ， 仲胺N 占 50%，叔 胺 N 為 25%[92,93]，受連 接環(huán)境的影響， 三種 N 質(zhì)子化 能力有所差異，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中所起的作用也就不一樣。 TMO 自發(fā)地與 RSVa3熒光素酶質(zhì)粒形成 納米 復(fù)合物 [88]， 該 復(fù)合物轉(zhuǎn)染 COS1和 Caco2細(xì)胞， TMO與 DNA形成的 TMO/ DNA納米 復(fù)合物直徑為 200~500 nm， 該復(fù)合物 轉(zhuǎn)染 COS1 細(xì)胞效率低于 DOTAP/DNA 脂質(zhì)納米粒， 而 殼聚糖 /DNA 納米復(fù)合物 在 Caco2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 效率與 DOTAPDNA 脂質(zhì)納米粒相當(dāng) 。高 純度的 殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量分別為 5000， 500010000， 10000）和 DNA 形成地復(fù)合 物 在電荷比（＋ /）為 1:1時(shí)就幾乎完全 抑 制核酸酶（ DNase）的降解，而且低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖能靜脈 給 藥 而 無(wú) 22 肝臟積累 [85]。殼聚糖 /DNA 的比率（即 N/P）是影響復(fù)合物粒子粒徑大小的關(guān)鍵因素，當(dāng) N/P為 3－ 8 時(shí)，產(chǎn)物粒徑為 100－ 250 nm， － 的一系列質(zhì)粒 DNA 并不影響復(fù)合物的粒徑。隨著脫乙?；潭鹊奶岣?，殼聚糖親水性增加。 Dekie [76]考察了它們的理化性質(zhì)，認(rèn)為它們 都能 與 DNA 形成納米復(fù)合物，粒徑大約在 80~100nm，粒徑隨聚合物組成、結(jié)構(gòu)和電荷比率的不同而不同。帶有正電荷的融合多肽 KALA 通過(guò)與共聚物 /DNA 20 復(fù)合物表面 離子 的 靜電 作用，形成 帶 正電荷的 KALA/PEGPLLDNA 復(fù)合物。在這個(gè)體系中 ， 唾液血清粘蛋白（ asialoorosomucoid）修飾聚賴氨酸，增加了 DNAPLL 復(fù) 合物 對(duì) 肝細(xì)胞的靶向性，促進(jìn)肝細(xì)胞的吸收。 聚賴氨酸 分子中有許多伯氨基，能很好地濃縮 DNA 而被廣泛用作基因載體材料。 陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的機(jī)制 陽(yáng)離子聚合物 /DNA 納米復(fù)合物表面過(guò)剩正電荷能促進(jìn)細(xì)胞的吸附，再通過(guò)膜的融合或內(nèi)吞作用將 DNA 轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)涵體， DNA 從內(nèi)涵體釋放， 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。聚合 物/DNA 納米 復(fù)合物進(jìn)入 體循環(huán)后 ，它將同細(xì)胞外的一些物質(zhì)相互作用，血漿中的白蛋白會(huì)立即吸附到納米復(fù)合物上，同時(shí)，還會(huì)受到體內(nèi)的一些聚陰離子的攻擊。陽(yáng)離子聚合物 /DNA 的復(fù)合可以減少聚合物表面的正電荷，降低聚合物的毒性。 在這個(gè)結(jié)構(gòu)中疏水核 是 部分中和的 DNA， 形成殼的是親水的陽(yáng)離子聚合物鏈段 ， 這種核 殼結(jié)構(gòu) ， 增大了體系在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性 ， 保護(hù) DNA 在傳遞過(guò)程不變 DNA 酶的降解。另外，可以合成相對(duì)分子質(zhì)量大小不同、結(jié)構(gòu)多樣的接枝和嵌斷共聚物，如 一個(gè)陽(yáng)離子鏈段和一個(gè)親水鏈段結(jié)合形成 的 嵌斷共聚物， 該 共聚物能自發(fā)與 DNA 形成共 聚物膠束，具有較高的膠體穩(wěn)定性 [58]。 陽(yáng) 離子聚合物 （ cationic polymer） 陽(yáng)離子聚合物 (cationic polymer), 又稱聚陽(yáng)離子（ polycation） ,是一類表面帶有正電荷的高分子聚合物。 3 在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用 Wareing 等 [53]通過(guò)向豚鼠耳蝸顯微注射陽(yáng)離子納米 脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物，轉(zhuǎn)基因表達(dá)在感覺(jué)神經(jīng)上皮內(nèi)持續(xù)達(dá) 14 天，靶器官周圍組織沒(méi)有發(fā)生毒性和炎癥反應(yīng)。結(jié)果腫瘤得到了明顯抑制，且轉(zhuǎn)染效率與給藥的次數(shù)有關(guān)（多次給藥基因表達(dá)的水平為單次給藥的 倍，而且存活時(shí)間也明顯延長(zhǎng)）。實(shí)驗(yàn)的可行性和安全性預(yù)示了陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體在基因治療中的潛在應(yīng)用前景。 納米脂質(zhì)體在基因治療中的應(yīng)用 納米脂質(zhì)體尤其是陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體可用于介導(dǎo)許多組織細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，既可轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)染體內(nèi)組織細(xì)胞。復(fù)合物可使內(nèi)涵體膜穩(wěn)定性降低，引起細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性陰離子脂質(zhì)的方向突變（ flipflop），擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)涵體后與陽(yáng)離子脂質(zhì)形成電中性的離子對(duì)，并從復(fù)合物中置換出 DNA 并使之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞通過(guò)微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或肌動(dòng)蛋白微絲等主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將含 DNA 的微粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至核 周圍 [39]。復(fù)合物中的 DOPE 有很好的融合性，在酸性條件下可使內(nèi)涵體膜穩(wěn)定性降低，并促進(jìn)復(fù)合物與內(nèi)涵體膜的融合。鑒于基因轉(zhuǎn)染在通常情況下需要較長(zhǎng)的時(shí)間，人們提出了陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物可能通過(guò)質(zhì)膜上的小孔進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制 [44]，不過(guò)