【正文】 原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植物，有些植物得到體細(xì)胞雜種， 這無論在理論和實(shí)踐上都有重要價值。組培苗的無毒生產(chǎn)， 可減少病害傳播，更符合國際植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)的要求，擴(kuò)大產(chǎn)品的流通渠道，增加產(chǎn)品市場的銷售能力，同時減少了氣候條件對幼苗繁殖的影響，緩和了淡、旺季供需矛盾。更重要的是應(yīng)降低組培苗工廠化生產(chǎn)的成本，只有降低成本，才能更好的投產(chǎn)應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，用于培養(yǎng)器皿的洗滌，最好是內(nèi)襯白瓷磚的水泥槽。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。 6．磁力攪拌器 磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各 種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等 。如果培養(yǎng)基溫度過高，測量時要調(diào)整 pＨ計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。通常以電作能源。 無菌操作室要求干爽安靜，清潔明亮，在適當(dāng)位 置吊裝 1～ 2盞紫外線滅菌燈，用以經(jīng)常地照射滅菌。接種箱可參考圖 2－ 1 自行仿制。超凈空氣的流速為每分鐘 24～ 30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈對器械等的灼燒消毒。 5．?dāng)R架 貯放高壓滅菌后等待接種的培養(yǎng)基。寬度一般為 60cm。 第二節(jié) 設(shè)備和器材 一、玻璃器皿 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和 進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。可用于培養(yǎng)較高的試管苗 ，另外也不易污染。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時是非常方便的。 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括 100、 250、 1000 毫升燒杯； 100、 1000 毫升量筒； 100、 1000 毫升試劑瓶（棕色）等等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長分化表現(xiàn)良好， 大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在 23～ 27℃之間進(jìn)行 ， 很多研究者采用了 25177。 桃胚在 2～ 5℃條件進(jìn)行一定時間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。 １～２個大氣壓對生長有促進(jìn)作用，２個大氣壓以上就對生長有阻礙作用， ５～６個大氣壓生長就完全停止，６個大氣壓細(xì)胞就不能生存。調(diào)節(jié)時一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉? 2．植物組織培養(yǎng)常用的設(shè)備和器材有：玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；器械用具，如鑷子、剪刀、解剖刀、解剖針等；儀器設(shè)備，如超凈工作臺、冰箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等。 培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是 Ｓ acks(1680)和Ｋ nop(1681)，他們對綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究， 根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Ｓ acks 和Ｋ nop 溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適， 可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低， 適于生根培養(yǎng)。常用培養(yǎng)配方如下： 表 3－ 1 MS和 White培養(yǎng)基配方 表 有機(jī)物 ＭＳ (毫克 /升 ) Ｗ hite (毫克 /升 ) ＮＨ 4ＮＯ 3 １６５０ ＫＮＯ 3 １９００ ８０ Ｃ aＣ l2２Ｈ 2Ｏ 0． 25 H3BO3 ＫＩ ０ .８３ ０ .７５ 煙酸 (Vpp) ０ .５ ０ .５ 鹽酸吡多醇 (VB6) 0． 5 0． 1 鹽酸硫胺素 (VB1) ０ .１ ０ .１ 肌醇 100 甘氨酸 2 3 21 二、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、 無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。在制備培養(yǎng)基時以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式供應(yīng)。在植物組織培養(yǎng)過程中， 向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對Ｎ的吸收， 增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。它們常以Ｍ gＳＯ 4 在制做培養(yǎng)基時不用Ｆ e2（ＳＯ 4） 3和Ｆ eＣ l3 （因其在 pH５ .２ 以上，易形成Ｆ e（ＯＨ） 3 的不溶性沉淀），而用 Ｆ e ＳＯ 4如缺氮，會表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長。 不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。 VB1 對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用， VB6 能促進(jìn)根的生長， VPP 與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其它的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 ①椰乳 是椰乳的液體胚乳 。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進(jìn)作用。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。 IAA（吲哚乙酸）是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低 ,是生長素中活力 最弱的激素， 對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的 IAA分解酶降解，受光也易分解。生長素常配成 1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。其中 ZT 活性最強(qiáng)，但非常昂貴。 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用 mg/L（即 ppm）表示濃度。若濃度過低，凝固性不好，新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。 （ 2)其它 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來造成的。它可以吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的 5－羥甲基糖醛。 第二節(jié) 培養(yǎng)基的制備 一、 母液的配制和保存 在組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常工作。藥品 的稱量及定容都要準(zhǔn)確。然后倒入 1000ml 定容瓶中，再加水定容至刻度，即成為１０倍母液。因?yàn)榧に赜昧枯^少，一次可配成５０ ml 或１００ ml。 配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時應(yīng)取的量。然后再傾入定容瓶余下的液體培養(yǎng)基。 表 3－ 2 ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制 化 合 物 名 稱 規(guī)定量 擴(kuò)大 倍數(shù) 稱取量 母液 體積 1L 培養(yǎng)基 移取量 ＮＨ 4ＮＯ 3 1650 10 16500 1000 100 母 液 1 ＫＮＯ 3 １９００ 1900 10 19000 CaCl7H 2O 100 2870 31 Na2EDTA 100 3730 煙酸 (Vpp) 50 25 500 10 母 液 3 鹽酸吡 多醇 50 25 鹽酸硫 胺素 50 5 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 2 50 100 四、培養(yǎng)基的分裝與滅菌 培養(yǎng)基合成后，要趁熱分裝， 100ml 的 容器約裝入 3040ml 培養(yǎng)基，即 1升培養(yǎng)基約裝 35 瓶左右。打開鍋蓋，加水至水位線。選擇 最佳培養(yǎng)基。 二、多因子試驗(yàn) 對培養(yǎng)基中兩個或兩個以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個因子的每個水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究 NAA 和 6BA 的最佳濃度組合，每個因子各設(shè) 5個濃度水平（ 0、 、 、 10μ mol/l），這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個具有 25項(xiàng)處理的試驗(yàn)（表 3－ 3）。mol/l） 0 5 10 NAA （ 181。這五種成分有各自的作用效果和要求。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多?；瘜W(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。依此觀點(diǎn)，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。即先配成大量元素 10 倍液，定容至 1000ml；微量元素 100倍液，定容至 1000ml；鐵鹽 100倍液，定容至 1000ml；維 生素 1mg? l，定容至 100ml；激素 1mg? l，定容至 50～ 100ml。在逐步添加時是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡化，以降低成本和利于推廣。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用 正交試驗(yàn) 。 一、單因子試驗(yàn) 單因子試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中其它成分都維持在一般水平上，只變動一個因子，以找出這一因子對試驗(yàn)的影響和影響的程度，例如 MS 基本培養(yǎng)基的其它成分和用量都不變，只變動 NAA用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。然后蓋上鍋蓋，對角旋 緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至 ，打開放氣閥放氣，回“ 0”后關(guān)閉放氣閥。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。7H 2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4 培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 PH值。均置入１０００ ml定容瓶中 ,若不加任何激素，則為ＭＳ０培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。然 后才能加水定容。用分析天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至 1000ml。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液， 其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。 所謂母液是欲配制液的濃縮液，這可保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取，并便于低溫保藏。 活性炭在生根時有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的 IAA，但 IAA易受可見光的光氧化而破壞，因 28 此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了 IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)了莖、葉的生長。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染 ，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時間。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、 pH 值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。 26 5．培養(yǎng)材料的支持物 (1) 瓊脂 在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。 在培養(yǎng)基中添加 細(xì)胞分裂素有三個作用： ①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長，細(xì)胞分裂素與生長素相互作用， 當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素／生長素的比值高時，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化 出不定芽 。此外，赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當(dāng)生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。 NAA 和 IBA 廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。 （ 1）生長素類 在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。用量為１５０～２００克 /升。一般使用濃度在１０～２０％，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。 (3)肌醇 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。Ｂ、Ｍ n、Ｚ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長，分裂異常。用量為１～３ mg/l 較為適宜； Ｃ a 是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ｃ a 對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯 22 著作用，常以Ｃ aＣ l2 (3)鉀 是植物營養(yǎng)Ｎ、Ｐ、Ｋ之一。銨態(tài)氮對植物生長較為有利。 它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。７Ｈ 2Ｏ ３７０ ７２０ Ｋ H2ＰＯ 4 １７０ Ｆ eＳＯ 4 其特點(diǎn)是成分較簡單，ＫＮＯ 3 和（ＮＨ 4） 2ＳＯ 4 含量高。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。而到 60 和 70 年代則大多采用ＭＳ等高濃度培養(yǎng)基， 可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要， 并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入 ,也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 復(fù)習(xí)思考題 1．因地制宜建一個組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，需要哪些組成部分？各部分的作用是什么？ 2．常規(guī)組織培養(yǎng)時，需要什么設(shè)備和器械？你是否會用？ 3．組 織培養(yǎng)中， PH有什么作用？如果 PH 過高或過低會有什么后果？ 4．談?wù)劷M織培養(yǎng)中如何根據(jù)外植體的不同調(diào)整適宜的培養(yǎng)溫度？ 第三章 培養(yǎng)基 目的要求： 1．一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)和各自的作用 2．掌握基本培養(yǎng)基的配方 3．一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量 4．掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟 5．熟練掌握培養(yǎng)基的分裝和滅菌方法 6．一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法 培養(yǎng)