核酸提取及常見問題分析ok(完整版)
【正文】 劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； ? 釋放出來的 DNA和 RNA由于在特定 pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離； ? 有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈 RNA。 線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的 比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。 快捷高效。核酸提取及常見問題分析 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作 。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 提取常見問題、原因分析及其對策DNA提取的基本步驟 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) 材料準(zhǔn)備 ? 最好使用新鮮材料， 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 ? 提取血液基因組 DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） ? 組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成 DNA降解 ? 含病毒的液體材料 DNA含量較少，提取前先富集 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） ? 培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 ? 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解 ? 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致 DNA量少，純度低 ? 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： ? 植物材料－－液氮研磨 ? 動物組織－－勻漿或液氮研磨 ? 組培細(xì)胞－－蛋白酶 K ? 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠 ? 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 菌體量適當(dāng) ? 培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮 ? 變性的時間不要過長（ 5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 ? 復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組 DNA的污染 ? G＋ 菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 核酸分離、純化 ? 采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 ? 采用有機(jī)（酚 /氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔 ? 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 ? 針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚 /氯仿抽提 ? 使用變性劑變性（ SDS、異硫氰酸胍等） ? 高鹽洗滌 ? 蛋白酶處理 ?多糖的去除： ? 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2體積的 5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 ? 異硫氰酸胍 /苯酚法 ? 步驟 : ? 材料準(zhǔn)備： 盡量新鮮。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀 RNA。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機(jī)相 ， 加入氯仿后首先混勻 ，
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