【正文】 、王曉艷、左勇 課題 3 ： 代謝相關(guān)蛋白質(zhì)修飾的分子調(diào)控機(jī)理及其在腫瘤發(fā)生中的作用與機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 在培養(yǎng)細(xì)胞系中初步建立乙?；确g后修飾調(diào)控代謝的信號網(wǎng)絡(luò)；建立代謝物調(diào)控細(xì)胞表觀遺傳及下游蛋白的信號網(wǎng)絡(luò)；建立乙酰化等翻譯后修飾調(diào)控腫瘤發(fā)生的動物模型；通過臨床研究認(rèn)代謝相關(guān)翻譯后修飾在腫瘤發(fā)生過程中的變化規(guī)律。其中，課題一著重建立修飾蛋白組相關(guān)技術(shù)，系統(tǒng)地鑒定代謝相關(guān)蛋白質(zhì)修飾酶和底物，比較這些修飾在腫瘤發(fā)生過程中的變化；課題二通過遺傳及代謝組學(xué)方法，系統(tǒng)鑒定上游修飾酶及這些修飾酶對于代謝組的調(diào)控；課題三則通過選擇一些關(guān)鍵蛋白修飾酶和靶蛋白， 剖析蛋白質(zhì)修飾的功能和調(diào)控機(jī)制，建立代謝相關(guān)蛋白修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；課題四在上述研究課題的基礎(chǔ)上，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究技術(shù)平臺，篩選能干預(yù)蛋白質(zhì)修飾的活性小分子化合物。 ? 獲得 35 個可以表達(dá)修飾酶的載體，表達(dá) 23 個酶并力爭獲得蛋白晶體 ； ? 建立內(nèi)源性小分子的分析方法： 包括分析樣品的制備方法、 LCMS/MS 方法、NMR 方法。 第 三 年 ? 繼續(xù)開展乙?；{(diào)節(jié)代謝機(jī)理的研究，重點轉(zhuǎn)向研究乙?；绾螀f(xié)同調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的糖酵解和三羧酸循。 ? 繼續(xù)進(jìn)行代謝物影響羥基化及甲基化的機(jī)理研究，研究如何通過小分子干預(yù)消除代謝中間物失調(diào)帶來的促腫瘤效應(yīng) 。 ? 完善代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫 。重點研究蛋白質(zhì)合成的精確控制機(jī)制；蛋白質(zhì)折疊尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒 體氧化折疊系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)；分子伴侶在錯誤折疊蛋白的修復(fù)與降解中的作用；應(yīng)激條件下質(zhì)量控制體系中蛋白質(zhì)的氧化還原修飾調(diào)控；蛋白質(zhì)異常修飾在細(xì)胞及動物水平產(chǎn)生的影響。解析線粒體 Mia40Erv1和 Mia40底物蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，解析線粒體膜間隙中血紅素 /銅轉(zhuǎn)運蛋白和其他具有重要生物學(xué)功能的蛋白的結(jié)構(gòu)，闡明線粒體的氧化折疊電子傳遞機(jī)制。 28 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo)： 本項目圍繞蛋白質(zhì)的生成、修飾與質(zhì)量控制這一關(guān)鍵科學(xué)問題，主要研究蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)的氧化折疊與氧化還原修飾、蛋白質(zhì)錯誤折疊及分子伴侶的作用、蛋白質(zhì)的異常修飾與疾病的關(guān)系，探討質(zhì)量控制失衡與蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。申請專利 35項 5．培養(yǎng)該領(lǐng)域戰(zhàn)略領(lǐng)軍人才 23 名、副教授 /研究員及高級技術(shù)型人才 46名、博士后 1015 名、碩博生 3050 人，建設(shè)一支具有國際競爭力的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究隊伍。 課題 1 研究技術(shù)途徑示意圖 課題 2 蛋白質(zhì)氧化折疊與氧化還原修飾 首先建立蛋白質(zhì)巰基氧化還原修飾的評價體系，篩選出氧化還原敏感的蛋白質(zhì)靶點，建立體外及體內(nèi)研究蛋白質(zhì)氧化折疊與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的關(guān)鍵蛋白的研究模型。 32 課題 3 研究技術(shù)途徑示意圖 課題 4 蛋白質(zhì)異常修飾與與疾病的關(guān)系 從蛋白質(zhì)的異常修飾、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的修飾及其相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)、動物模型的建立，再到認(rèn)知功能損傷的學(xué)術(shù)研究途徑。本項目緊扣本領(lǐng)域前沿，在原有工作基礎(chǔ)上創(chuàng)建巰基氧化還原修飾的定量高通量檢測方法，系統(tǒng)研究氧化還原修飾34 對質(zhì)量控制體系不同環(huán)節(jié)關(guān)鍵蛋白的體內(nèi)外功能調(diào)控，揭示蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的新機(jī)制，有望取得創(chuàng)新和特色成果。 3. 前期工作基礎(chǔ)扎實 本項目研究團(tuán)隊在蛋白質(zhì)合成、折疊、修復(fù)、降解及氧化還原修飾研究等方面，已有著非常扎實的研究基礎(chǔ)，本項目團(tuán)隊成員發(fā)表的與本項目相關(guān)的通訊作者 /第一作者研究論文中，在 Cell、 Nature、 Science 及子刊上 3 篇，影響因子大 10的有5 篇，影響因子 105 之 間的有 43 篇。以亮氨酰 tRNA 合成酶（ LeuRS）為代表，研究不同來源的 LeuRS 之合成和編校功能的特點，闡明在蛋白質(zhì)生物合成起始階段質(zhì)量控制的機(jī)理。 主要 研究內(nèi)容： 1. 發(fā)展新的巰基氧化還原修飾檢測的蛋白質(zhì)組學(xué)方法 在已經(jīng)建立的 IBP 方法的基礎(chǔ)上發(fā)展基于 SILAC （ stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）的定量方法來定量發(fā)生巰基修飾的蛋白質(zhì)，篩選出蛋白質(zhì)折疊體系中氧化還原修飾敏感的關(guān)鍵蛋白靶點，研究氧化應(yīng)激 /氮應(yīng)激對蛋白質(zhì)氧化折疊及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的調(diào)控機(jī)制。 4. 蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基氧化還原修飾研究 鑒定分子伴侶、泛素化降解途徑關(guān)鍵蛋白和自噬過程相關(guān)蛋白的巰基修飾位點。在正常和應(yīng)激條件下，通過已建立的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，比較Ure2 存在、缺失以及處于 Prion 狀態(tài)時，酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞硝基化和谷胱甘肽化修飾情況，而闡釋 Ure2 的 GRX 活性可能的生理功能。 (2) 翻譯后修飾及大分子擁擠對蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控 以人 Prion 和 Ataxin3 （ Atx3） 等蛋白質(zhì)為對象，結(jié)合體內(nèi)和體外研究方法，研究糖基化、磷酸化修飾，泛素化修飾和 GPI 定位修飾以及大分子擁擠對模型蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控機(jī)制。 2. 分子伴侶和輔伴侶對蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的作用 (1) 分子伴侶對 Prion 蛋白、 Tau 蛋白錯誤折疊和聚集的作用 以人 Prion 蛋白及其病理突變體，過磷酸化修飾的 Tau蛋白及其病理突變體為研究對象，用各種生化和細(xì)胞技術(shù)研究分子伴侶 Hsp70A1A（ Hsp70家族成員）和 ERp57（ PDI 家族成員）對這兩個蛋白質(zhì)病理性錯誤折疊的調(diào)控機(jī)制。將用 NMR、熒光及其它生化方法體外篩選和設(shè)計能夠阻止α Syn/Sph1 兩者相互作用以 及α Syn 聚集和包涵體形成的小分子化合物；并在細(xì)胞模型中驗證這些化合物對α Syn 聚集和包涵體形成以及細(xì)胞毒性的影響。 主要研究內(nèi)容： 綜合應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的先進(jìn)技術(shù)方法，研究神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的錯誤折疊和包涵體的 形成，分子伴侶以及輔伴侶在蛋白質(zhì)錯誤折疊的發(fā)生和清除中的調(diào)節(jié)作用。以 CFTR、α Synuclein 以及酵母 Prion 蛋白 Ure2 等蛋白為模型蛋白，在體內(nèi)外研究蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白的巰基修飾對的淀粉樣纖維化的影響。鑒定 Ero1α、 Ero1β與 Prx4 的亞硝基化修飾及谷胱甘肽化修飾位點，體內(nèi)外研究巰基修飾對酶活性的影響，在細(xì)胞水平檢測巰基修飾對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化折疊過程的影響。 3. 蛋白質(zhì)跨膜前的新因子 LepA/Guf1 使用體內(nèi)定點光交聯(lián)、化學(xué)交聯(lián)、免疫印跡、免疫共沉淀、 串聯(lián)親和標(biāo)簽技術(shù)36 結(jié)合質(zhì)譜等手段考察 LepA/Guf1 和其他因子的相互作用；采用分子生物學(xué)和生物化學(xué)的方法研究 LepA/Guf1 翻譯阻滯與蛋白質(zhì)合成的關(guān)系；利用基因突變，條件敲除等實驗手段研究 LepA/Guf1 與 SRP 的系統(tǒng)效應(yīng)。 4. 良好的工作條件和環(huán)境保障項目的順利實施 本項目依托、承擔(dān)和參加研究單位（中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)院上 海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所、中國科技大學(xué)、北京大學(xué)和武漢大學(xué)）都屬于國內(nèi)一流的科研院校，有很強(qiáng)的綜合科研實力，尤其是大部分科研骨干都依托于國家級、省部級重點實驗室，包括生物大分子國家重點實驗室、腦與認(rèn)知國家重點實驗室、分子生物學(xué)國家重點實驗室、合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家實驗室（籌）、病毒學(xué)國家重點實驗室等，為本項目的開展提供了非常好的工作環(huán)境和研究條件，滿足本項目在儀器設(shè)備和技術(shù)方法的需求。項目中各課題研究內(nèi)容和方案清晰明確切實可行。 2. 學(xué)科交叉，優(yōu)勢互補(bǔ) 本項目研究隊伍的特色是多數(shù)負(fù)責(zé)人和學(xué)術(shù)骨干都在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究方面有很好的積累。所選蛋白質(zhì)都有較好的遺傳學(xué)背景和臨床病理現(xiàn)象，所取得的研究成果將能夠為探索病理機(jī)制和防治方法提供依據(jù)。 技術(shù)途徑 本項目依據(jù)已有工作基礎(chǔ)，設(shè) 臵 四個緊密關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制研究課題，包括 1）蛋白質(zhì)生物合成的質(zhì)量控制、 2）蛋白質(zhì)氧化折疊與氧化還原修飾、 3）蛋白質(zhì)錯誤折疊及分子伴侶的作用、 4）蛋白質(zhì)異常修飾與疾病的關(guān)系，針對擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題聯(lián)合攻關(guān)，獲得蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和修飾調(diào)控的創(chuàng)新研究方法和平臺，以及質(zhì)量控制分子機(jī)制的全景網(wǎng)絡(luò)；在應(yīng)用成果方面獲得能夠試用于老年性癡呆癥臨床診斷的生物標(biāo)記物；篩選調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的小分子化合物。 2．在蛋白質(zhì)合成的精確控制機(jī)制、氧化折疊關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究及氧化折疊的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、蛋白質(zhì)錯誤折疊與聚集的機(jī)理、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的氧化還原調(diào)控機(jī)制方面取得系統(tǒng)研究成果和突破進(jìn)展。 4． 蛋白質(zhì)錯誤折疊聚集的機(jī)制 以幾個與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的淀粉樣蛋白質(zhì)（ Prion、 Tau、α Synuclein、TDP4 PolyQ 蛋白）為模型和對象，綜合應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的先進(jìn)技術(shù)方法，研究蛋白質(zhì)的錯誤折疊、淀粉樣聚集和包涵體形成的分子機(jī)制和生物效應(yīng)；蛋白質(zhì)翻譯后修飾及大分子擁擠對蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控；蛋白質(zhì)錯誤折疊和疾病發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系以及篩選和設(shè)計對蛋白質(zhì)聚集和包涵體具有調(diào)控功能的小分子化合物。探索環(huán)境因素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)異常修飾與認(rèn)知障礙之間的關(guān)系，開發(fā)試用于老年性癡呆癥臨床診斷的生物標(biāo)記物。 ? 初步建立乙?；揎椪{(diào)控代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，重點建立腫瘤相關(guān)糖酵解及三羧酸循環(huán)受乙?；瘏f(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ； ? 建立代謝物調(diào)控細(xì)胞信號通路的網(wǎng)絡(luò)體系，重點建立三羧酸循環(huán)代謝物對細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)作用 ； ? 形成較為完整的蛋白質(zhì)乙?；?、甲基化、羥基化修飾組數(shù)據(jù)庫 ； ? 全面驗證小分子化合物的調(diào)節(jié)修飾酶作用及對腫瘤細(xì)胞的抑制效果 。 ? 根據(jù)腫瘤細(xì)胞代謝通路乙?；奶攸c，定向調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的乙?；揭赃_(dá)到調(diào)控代謝通路相 對活性的目的，實現(xiàn)對腫瘤生長的抑制，申報 12 項發(fā)明專利 ； ? 發(fā)現(xiàn)系列可以回復(fù)因代謝中間物失調(diào)影響到小分子活性化合物，申報專利并發(fā)表研究論文 ； ? 獲得全細(xì)胞水平蛋白甲基化、羥基化修飾組，為中長期研究奠定基礎(chǔ) 。 ? 開始代謝物及代謝組學(xué)分析。 ? 繼續(xù)乙?；⑷ヒ阴；?、甲基化、羥基化等目標(biāo)蛋白的表達(dá)及結(jié)晶，并開始利用獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計并合成可影響酶活的小分子化合物 。 ? 建立蛋白質(zhì)羥基化和甲基化修飾組學(xué)分析平臺 。 2． 研究蛋白質(zhì)修飾酶全酶或多個結(jié)構(gòu)域的活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。 課題設(shè)置 課題 1 ： 代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)的修飾譜及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的變化規(guī)律 預(yù)期目標(biāo)： 利用修飾 /比較蛋白組學(xué)方法研究代謝相關(guān)翻譯后修飾的底物 ,以及這些修飾在腫瘤發(fā)生過程中 的變化規(guī)律。 3. 本項目聚集了國內(nèi)近年來在該領(lǐng)域取得國際水平成果的研究團(tuán)隊，以及一批近年來從包括 Craig Thompson及 Dang . 實等國際代謝與腫瘤領(lǐng)域頂級實驗室全職回國的精干年輕研究人員，知識結(jié)構(gòu)和研究理念處于國際前沿。 根據(jù)上述對干預(yù)修飾酶活性的小分子化合物的生化、生理、病理研究，結(jié)合小分子化合物與修飾酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)特點，通過改變修飾酶與小分子結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元素，結(jié)合生物化學(xué)、18 分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)等手段，驗證其生物學(xué)功能，為治療修飾酶相關(guān)疾病提供小分子藥物設(shè)計和優(yōu)化的結(jié)構(gòu)模板。核受體 (nuclear receptor,NR)是一類在生物體內(nèi)廣泛分布的配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，在代謝、發(fā)育、癌癥等方面起著重要調(diào)節(jié)作用。但是，多個結(jié)構(gòu)域是如何相互作用來協(xié)調(diào)完成蛋白修飾的？各種修飾酶在不同復(fù)合體中的空間排布及結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制存在什么樣的機(jī)制和差異？與相對保守的催化活性結(jié)構(gòu)域不同的是，修飾酶的其他區(qū)域具有較大的非保守性和多樣性。 1. 研究雙加氧酶的催 化機(jī)制，以及各種小分子，如系統(tǒng)研究代謝中間物α KG等，是如何影響各種修飾酶對底物的識別和催化活性的調(diào)控 我們將重點解析以雙加氧酶相關(guān)蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能。 2. 通過培養(yǎng)的細(xì)胞系研究代謝物對細(xì)胞表觀遺傳及下游信號通路的調(diào)控。因此，本方向還將同時采用比較研究策略分析正常及腫瘤細(xì)胞的乙?；鞍妆磉_(dá)特征和代謝物譜及代謝通路 特征；通過綜合使用各類高通量信息提取和多元化分析技術(shù)，分析生化網(wǎng)13 絡(luò)在常態(tài)和病態(tài)下的結(jié)構(gòu)組成和動態(tài)變化。當(dāng)標(biāo)記的樣品與不標(biāo)記的樣品混合時，在質(zhì)譜中成對出現(xiàn)的峰就是甲基化的肽段，從而將其與大量的非修飾肽區(qū)分出來。我們發(fā)展了一種具有 自主知識產(chǎn)權(quán)的基于鈦離子的固定親和色譜（ Ti(IV)IMAC）的磷酸肽富集技術(shù)，比常規(guī)富集技術(shù)能鑒定更多的磷酸肽；在磷酸肽鑒定的數(shù)據(jù)處理方面，發(fā)展了一種結(jié)合二級和三譜高可信鑒定磷酸肽的方法，開發(fā)了一個磷酸化蛋白質(zhì)組分析專用的軟件。 2. 利用抗體親和富集技術(shù)開展蛋白質(zhì)組乙?；M分析。 學(xué)術(shù)思路 圍繞代謝相關(guān)蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控腫瘤發(fā)生這個核心主題，我們將聚焦代謝調(diào)控機(jī)制與代謝物和代謝下游信號通路這三個關(guān)鍵因素，解析如下主要科學(xué)問題：1，腫瘤細(xì)胞中與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的作用與調(diào)控機(jī)制； 2，腫瘤過程中與蛋白質(zhì)修飾調(diào)控相關(guān)的代謝中 間物產(chǎn)生的特點與機(jī)制； 3，腫瘤過程中與蛋白質(zhì)修飾調(diào)控相關(guān)的代謝中間物對腫瘤相關(guān)信號通路的影響。 4. 解析 3－ 5個代謝相關(guān)蛋白修飾調(diào)控酶的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計并優(yōu)化5－ 10個可以調(diào)節(jié)代謝或抑制代謝相關(guān)腫瘤發(fā)生信號通路的藥物先導(dǎo)