【正文】 (1)原理：垂體后葉素能使冠狀動脈痙攣，造成急性心肌供血不足，從外周阻力增加．導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，心電圖可見心肌缺血的典型變化，適用于緩解冠狀動脈痙攣以防治心肌缺血藥物的初篩方法；垂體后葉素能收縮全身 (特別是內(nèi)臟 )小血管，作用是非特異的。 判定指標(biāo)同大鼠。 (3)注意點：適用于研究影響心肌氧代謝平衡或作用受體而防治心肌缺 血的藥物，用心電圖難于定量觀測藥物的作用，須用病理觀測，但制備病理標(biāo)本及觀察 量較大，難準(zhǔn)確定量，是其缺點，可用分級定度或半定量法觀測。 (4)注意事項：本實驗特點是不開胸，不結(jié)扎冠狀動脈，通過心電圖、血流動力學(xué)、生化 和病理研究以評價抗心肌缺血藥的治療作用。左心室尖部插管，連接壓力換能器，測定左室內(nèi)壓，再經(jīng)微分惻定左室內(nèi)壓上升最大速率。 (七 )冠脈循環(huán)實驗 1．原理 冠脈流量是評價防治心肌缺血藥物的重要指標(biāo)。 冠脈側(cè)支循環(huán)研究方法：實驗用健康成年犬，手術(shù)同前，開胸手術(shù)完成后，分離上動脈根部。停灌后 10 min，分別記錄心輸出量、冠脈反流量及反流壓，動脈壓及心率，作為給藥前對照值，然后給予實驗藥物。 Rb半衰期為 19． 5日，易于測定，對心肌有特殊的親和力，攝取量為骨骼肌的 2， 5倍，故適用于測定心肌營養(yǎng)血流量。 區(qū)域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球懸于含 o． 01％吐慍 80的生理鹽水內(nèi)，使用的置旋渦混合器 I— 2min，取微球 500萬，用生理鹽水稀釋到l0ml， 10s內(nèi)注入麻醉開胸犬左房導(dǎo)管，再用 10ml鹽水沖洗導(dǎo)管：注射微球的同時用恒速泵以 67ml／ min的速度從插人動脈弓的導(dǎo)管連續(xù)取 3份參考樣品，每份 40s。待心臟跳動規(guī)則后，在肺動脈起始處剪一小口，以利冠狀血回流液排出。藥物抑制心肌收縮力，可使血管阻力降低．冠脈流量增加，假陽性。可計算心肌耗氧。 2 間接測定 ①張力 — 時間指數(shù)，根據(jù)心肌耗氧量與心臟做功有密切關(guān)系的原理，間接推測心肌耗氧量的變化?？蓮钠鞴?、組織及細(xì)胞水平反映藥物對心肌耐缺氧能力的影響。 下面重點介紹幾種常用方法。所以當(dāng)測定系統(tǒng)將電極與被測溶液用能通過氣體分子的聚乙烯薄膜隔開后，在一定極化電壓下電極中測的電流量將只反映破測系統(tǒng)彌散過來的氧，故與被測溶液中的氧分壓成正比，與組織的耗氧成反比，從而可以反映組織的代謝活動?？捎貌ＡЦ稍锲鞔鎻V口瓶。臨床厥脫證已有較明確的辨證指標(biāo)和治療準(zhǔn)則。 二、藥效學(xué)研究的實驗設(shè)計 (一 )對厥脫證動物模型的治療作用試驗 1．常用動物模型 (1)失血性休克模型：用動脈急性放血的方法，急性失血達(dá)總血量的 15％ — 20％時，就發(fā)生休克，待血壓降至 5． 3kPa時便達(dá)到難逆性克。最常用的動物是豚鼠，其次是兔、大鼠、小鼠，犬等。氣血兩脫，由急性失血引起，即失血亡陰之脫證，用失血性休克代償期和失代償早期作為氣血兩脫證的動物模型，如為失代償晚期，屬陰陽俱脫證。 (4)治療劇烈疼痛致脫的藥物：可增加鎮(zhèn)痛等試驗。觀察血壓、呼吸、心電圖、最大放血量、存活率等。 15min時，各指標(biāo)有不同程度回升， 60min后，冉度出現(xiàn)降低，維持在休克時的水平．藥效根據(jù)給藥后上述指標(biāo)情況，觀察給藥后 2h內(nèi)，2h從 3h后，外周血壓指標(biāo)情況，應(yīng)與對照組有顯著差異。 2 ．操作方法 用犬以戊巴比妥鈉 25mg／ kg靜脈注射麻醉，分離股動脈與股靜脈，靜脈插管連接二通，一側(cè)供輸液，一側(cè)供給藥。 3 造模成功的指標(biāo)和藥物療效觀察 待犬 MAP穩(wěn)定在 10kPa以上時，每隔 5min順次結(jié)扎冠狀動脈前降支末梢、中部與根部，510min后阻斷冠狀竇血流。 (5)多巴胺 (DOP)是公認(rèn)的治療心源性休克有效藥物之一，能明顯改善本休克模型心肌收縮性能與心肌供血，升高血壓等。 (2)取樣時間要相等，測定各項指標(biāo)要精確。通過塑料三通左頸總動脈取血，分別測定夾閉前、松夾后 1h、 2h三個時間的全血谷胱肽過氧化物酶活力。 4 注意點 ①在分離大鼠腸系膜上動脈時，盡量避免出血或過多牽拉。心律失常同時涉及心臟電活動和機(jī)械性搏動的節(jié)律，但雖明顯最精確地從心臟電活動的改變中反映出來，因此心電圖是反映心律的最重要最直接的指標(biāo)。 中醫(yī)可用補(bǔ)益養(yǎng)血、滋陰和陽疏通血脈等方藥，防治“脈結(jié)代”，具抗心律失常的作用。腎上腺素興奮受體，心臟自律性、傳導(dǎo)性、應(yīng)激性及心率提高，誘發(fā)室性心律失常，②氯仿誘發(fā)小鼠的心室纖顫。⑥氯化鈣誘發(fā)的心律失常。②房顫或室顫發(fā)生率和死亡率。 (4)結(jié)扎冠脈、大鼠靜注烏頭堿形成的心律失常模型較穩(wěn)定和持久，可供實驗治療，其他模型多用于預(yù)防給藥。 受試藥給藥方法中至少有一種與臨床相同。 (二 )冠狀動脈結(jié)扎形成心律失常 1．原理 結(jié)扎冠狀動脈前降支 30min，再灌注 45min造成心肌急性缺血再灌注損傷模型。 2．方法 小鼠，雌雄各半，分組；給待測藥物，一定時間將小鼠放入倒扣的 500ml燒杯中，其內(nèi)放入浸有 3ml氯仿的人棉球 (以后每換 1只鼠加0． 5ml)。 (五 )強(qiáng)心苷誘發(fā)的心律失常 1．原理 毒毛旋花苷 G等強(qiáng)心甘直接抑制 Na、 KATP酶，使心肌細(xì)胞內(nèi)失鉀，導(dǎo)致心肌組織的靜息電位和最大舒張電位減小 (負(fù)值變小 )，而引起心肌自律性增高；使蒲氏纖維與心室肌接合部位單向傳導(dǎo)阻滯，而引起折返；中毒量的強(qiáng)心苷可引起暫時性去極化，導(dǎo)致振蕩后電位而引起異位節(jié)律出現(xiàn)室性早搏。皮下注射水合氯醛 0． 2g／ kg麻醉，背位固定手術(shù)臺記錄正常 ECG。算出出現(xiàn) VP、 VT、 VL和 CA所用毒毛旋花苷 G劑量，將給藥組與對照組相比，經(jīng)統(tǒng)計處理求出 P值。電生理實驗證明烏頭堿能加速心肌細(xì)胞 Na內(nèi)流，促進(jìn)細(xì)胞膜去極化，誘發(fā)異位節(jié)律點，縮短不應(yīng)期，而導(dǎo)致心律失常，由于烏頭堿誘發(fā)的心律失常較持久，可以實驗治療，也可以預(yù)防給藥。5min后剪斷縫線，取下橡膠管，使冠脈重新得到血液的灌流，在示波器監(jiān)視下紀(jì)錄給藥前后、復(fù)灌前后 ECG，紀(jì)錄復(fù)灌 15min內(nèi)室性心動過速、室顫及心跳停止發(fā)生中。 2．方法 ①貓雌雄不拘，體重 2— 3kg，戊巴比妥 (3545mg／ kg)腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸，開胸腔，切開心包膜，將作電極用的鋼制小夾分別置于心尖部和右心室底部 (或心尖部左側(cè)房室交界處 )或用雙極分別插在左室及心耳進(jìn)行連續(xù)刺激，刺激參數(shù)為波寬 1mm，頻率 20Hz，當(dāng)電流強(qiáng)度為0． 25mA時引起早搏， 1． 5mA引起室性心動過速， 1． 8mA引起室性過速和撲動， 2. 5mA引起室性纖顫。實驗采用常規(guī)心肌細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)。大動物 (狗、猴、豬 )心室纖顫很難自然恢復(fù)，研究病因狗最適宜，豬的冠狀血管系統(tǒng)與人相似，現(xiàn)在越來越多地采用小豬以冠狀動脈結(jié)扎的方法形成心律失常。 緩慢型心律失常模型 (1)維拉帕米 (異博定 )誘發(fā)小鼠緩慢型心律失常：抑制心肌細(xì)胞內(nèi) Ca流，抑制房結(jié)和減慢房室傳導(dǎo)。④弧心苷誘發(fā)的心律失常。 (1)電刺激心臟誘發(fā)心律失常：適度的電刺激接近自然異位沖動，可誘發(fā)心律失?！，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)抗心律失常的藥物主要分為四類：鈉通道阻斷劑，它主要抑制內(nèi)向快速除極，鈉流動，從而延長動作電位上升速度，主要分為三個亞類： In除極作用中等，而復(fù)極延長，如奎尼丁、普魯卡因酰胺、雙異丙腎上腺素等； Ib兼有促進(jìn) K外流作用，除極作用弱，復(fù)極作用縮短 (對 P— R、 QPS、 QT無影響 )，如利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英鈉； lc除極作用強(qiáng)，復(fù)極作用甚小，如普羅帕酮、氟卡胺、Lorinine等。④按酶學(xué)反應(yīng)的溫度、 PH和時間進(jìn)行，同時須準(zhǔn)確計時和讀數(shù)。其余條件均同給藥組。左頸總動脈插三通開關(guān)，按壓力換能器，連于二道生理記錄儀記錄血壓。三組動物血樣時間均相等。 4．注意點 (1)麻醉不能過深，動物 MAP低于 10kPa時棄去不用。頸外靜脈插入高敏感度壓力換能器達(dá)右心房測中心靜脈壓(CVP)，左股動脈測平均動脈壓。 (2)自制內(nèi)毒素可選用高毒力菌株增菌培養(yǎng)后刮下菌苔，然后按WestphaI熱酚法制備。 (二 )感染性休克模型 1．原理 內(nèi)毒素是細(xì)菌重要的致病因子之一，在微量時引起發(fā)熱，大量進(jìn)入血液則引起循環(huán)衰竭造成厥脫證而致死亡。 三、動物模型建立方法 (一 )厥脫癥失血性休克模型 1．原理 以動脈急性放血、急性失血達(dá)血量的 15％ 20％時，就可發(fā)生休克，待血壓降至 5． 3kPa(40mmHg)時便達(dá)到休克。 3．根據(jù)不同休克動物模型，增加有關(guān)病因的試驗 (1)治療邪毒內(nèi)陷之脫證的藥物：除進(jìn)行上述有關(guān)休克模型外，還做①祛邪相關(guān)的試驗，如抑苗、抗病毒、對抗毒索、抗炎、解熱等試驗。 2 觀察指標(biāo) (1)模型動物死亡率：小動物休克模型以休克動物死亡率的影響評價有效性?？蛇x用犬、貓、小型豬等。根據(jù)辨證原則，可分為氣陰兩虧，陽氣暴脫，真陰耗竭，熱毒熾盛，心氣不足，氣滯血瘀等六型，各型之間可以互相挾雜。 (4)小鼠低壓耐缺氧實驗法，本法與常壓耐缺氧實驗法相似，但將小鼠放入密封的低壓容器內(nèi)。 注意事項：本法為整體實驗，離體測定，可對正常心臟或缺血心臟進(jìn)行不同部位的心肌耗氧量測定，反映藥物對正常及缺血心肌耗氧的影響，方法簡便，快速、易普及，但影響因素較多，嘛醉、呼吸狀態(tài)及供氧情況，心肌標(biāo)本的處理從測氧條件的控制，儀器的穩(wěn)定性與靈敏以及實驗環(huán)境溫度的變化等，均可影響實驗結(jié)果作用。藥前及藥后不同時間抽取血樣進(jìn)行血氧測定，與其他血流動力學(xué)指標(biāo)同時紀(jì)錄相比較。深入研究藥物對這方面的影響，是必要的。①離體心臟灌流耐缺氧實驗，用不同程度的低氧或無氧流液灌流離體心臟，觀察心臟功能、形態(tài)及生化指標(biāo)的變化，可反映離體心臟對不同缺氧程度的耐受能力以及藥物的影響，并可用于受體作用的研究，但易受體外環(huán)境的影響，須嚴(yán)格擰制實驗條件。這方法儀器昂貴，國內(nèi)尚未廣泛應(yīng)用，③離體心臟心肌片或心肌組織及體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞耗氧量測定，離體心臟灌流，分別測定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧。左心室心肌耗氧量為每分鐘8— 10ml／ 100g(心肌 )，工作負(fù)荷增加時每分鐘可達(dá) 40ml／100g(心肌 )。 注意事項：藥物的 pH及無機(jī)離子含量血接近生理值，否則酸性藥液可增加冠脈流量，須用與藥物同樣 pH及無機(jī)離子的對照劑。 根據(jù)阻斷冠脈前后心肌組織內(nèi)血流量的變化．減少 25％以上者為缺血，減少大于 75％者為嚴(yán)重缺血區(qū)。 注意：①為防污染，全部操作在盤內(nèi)進(jìn)行．實驗后一并處理。 注意事項：本法研究藥物對犬或貓的冠狀靜脈竇流出量、心肌耗氧量的影響，簡單方便，作為初篩抗心絞痛藥物，能從供血與耗氧兩力面來評價。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，測量反流壓。為了解藥物對缺血區(qū)心肌實際供血情況，可在整體實驗動物中進(jìn)行冠脈側(cè)支循環(huán)、心肌區(qū)域血流量、心肌營養(yǎng)血流的研究，從不同角度反映藥物對冠脈循環(huán)的影響及防治心肌缺血的療效。將上述各項指標(biāo)同步錄于多道生理記錄儀。因此，心臟血流動力學(xué)指標(biāo)應(yīng)作為主要藥效學(xué)研 究內(nèi)容。 (3)觀測指標(biāo)：心電圖或體表標(biāo)測心電圖 ∑— ST及 N— ST改變。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素 2— 8mg／ kg，家兔 10— 16mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后 30min內(nèi)，每隔 5min記錄心電圖一次，第二次給藥后 24h記錄心電圖后殺死動物，取心臟做病理切片檢查。 正常大鼠注射腦垂體后葉素后心電圖變化分兩期： 第一期，注射即刻至 30s， T波升高， ST段抬高 (超過 o． 1mV)，尤以 l0s變化最明顯。②不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細(xì)胞的藥物的作用。 (2)心肌細(xì)胞搏動的變化：包括搏動的頻率、節(jié)律及強(qiáng)度等。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。②心肌丙醛 (ADA)含量及越氧化物歧化酶 (s0D)活性，實驗結(jié)束后，剪下再灌區(qū)全層心肌約 0． 2g，制備勻漿進(jìn)行測定。一般采用阻斷局部冠狀動脈血流一定時間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷?？捎檬腊そM織塊切片，染色，顯微鏡下觀測，分級定度或用定量組織學(xué)方法直接算心肌梗死面積。 (5)在進(jìn)行本項實驗時一定要嚴(yán)格控制實驗條件，排除干擾因素，確保實驗結(jié)果。 (4)血液流變性指標(biāo)測定：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學(xué)指標(biāo)。確定心肌缺血以 ST段抬高作為指標(biāo)，以 ST段抬高 ≥2mv的點數(shù)(N— ST)代表心肌缺血的范圍，以各點段抬高的毫伏數(shù)之和 (∑— ST)代表心肌缺血的程度。環(huán)植人 4— 6星期，血骨內(nèi)徑縮小 80％ 90％。西藥劑量與中藥量相差較大，作用特點亦不大相同，不做藥效強(qiáng)度比較。常用免或大鼠以 Chmldlcr血栓形成法，測定心栓的重量及長度；應(yīng)用大鼠以動 — 靜脈旁路法測定血栓濕重；電刺激人鼠頸總動脈形成動脈血栓，用