【正文】 kers, when annealed together and be added to the cDNA to provide stickyend cloning without digestion of the linkers. OHGATCCCCGGG DNA ligase CCCGGG GGGCCCCTAGOH 5’ GGGCCC GGATCC CCTAGG BamH I + OHGATCCCCGGG GGGCCC 5’ OHGATCCCCGGG GGGCCC CCCGGG GGGCCC HpaII Homopolymer tailing: the enzyme terminal transferase is used to add homopolymers of dA, dT, dG or dC to a DNA molecule. Pst I vector CCCCCCCC3’ 3’ CCCCCCCC Insert G G Pst I site GGGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGGG GACGT TGCAG CCCCCCCC CCCCCCCC Pst I site Enzyme digestion Terminal transferase + dC Pst I digestion Terminal transferase + dG DNA ligase Target gene ★ Main advantage: 1) packaging in vitro may generate the rebinant phage, which increases the efficiency of the cloning process. 2) much easier to store and handle large numbers of phage clones than plasmids. 3 Cloning cDNA in bacteriophage vectors If a large number of rebinants was required, and a lowabundance mRNA was to be cloned, phage vectors may be more suitable. Cloning cDNA in λvectors using linkers: EcoR I methylase CCGAATTCGG GGCTTAAGCC Add EcoR I linkers ds cDNA Me Me CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC Digest with EcoR I Ligate Insert vector vector LA λ vector RA ★ genomic library: is often used to describe a set of clones representing the entire genome of an anism. To determine the introns To examine the control sequences responsible for regulating gene expression 二、 Cloning from genomic DNA 1 Genomic libraries ★ aim of constructing a genomic library is for isolating a target DNA sequence. ★ Clone bank ( library ):A collection of independent clones is termed a clone bank or library 估計基因組文庫大小的經(jīng)驗（ empirical formula）公式： ? N=ln(1P)/ln(1a/b) ? N: the number of clones required ? P: desired probability of a particular sequence being represented( or ) ? a: the average size of the DNA fragment to be cloned ? b: the size of the genome anism Genome Size(kb) N,P= 20kb inserts 45kb inserts Escherichia coli (bacteria) 103 103 103 Saccharomyces cerevisiae (yeast) 104 103 102 Arabidopsis thaliana (simple plant) 104 104 103 Drosophila melanogaster (fruit fly) 105 104 104 Stroglyocentrotus purpuratus (sea urchin) 105 105 104 Homo sapiens(human) 106 105 105 Triticum aestivum (hexaploid wheat) 107 106 106 Geic library sizes for various anisms 選擇哪種載體用于基因組文庫構建？ Which vector is used to choose for construction of geic library? λ phage vector：有效容納量是 15kb cosmid vector：有效容納量是 45kb 建立基因組文庫的一般程序： 1．載體 DNA片段的制備 載體 DNA分離純化 限制酶切 脫磷酸化反應 3. 供體與載體 DNA連接 提高重組頻率，應注意連接反應體系中總 DNA濃度和兩 種 DNA分子的摩爾數(shù)比率。 原理 （兩個）：① 從轉錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp 的寡核苷酸序列標簽 (sequence tag, ST)，它含有確定的一個獨特轉錄物的足夠信息量，可代表此轉錄物的特異性。 19 6．篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術 （ 1）差別雜交法 差別雜交（ differential hybridization）或稱為差別篩選 (differential screening)法，特別適用于分離在特定組織中、發(fā)育的特定階段表達的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導表達的基因。 17 （ 2）計算機克隆 (silicon cloning)或生物信息學(bioinformatics)克隆新基因策略 生物信息學克隆新基因策略是表達序列標簽法的延伸和發(fā)展。 16 5．利用表達序列克隆目的基因 （ 1）表達序列標簽法分離目的基因 Expressed sequence tag，簡稱 EST：指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結構信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長度一般為 100~500 bp。 ② DNA Linker 預先設計，通過化學合成的寡聚核苷酸片段，含有 1種或幾種酶切位點，酶切可產(chǎn)生粘性末端。 2）偶聯(lián)反應（縮合反應，加成反應） 由溶于無水乙腈中的四唑催化，使亞磷酰胺單體的 3`磷酸基團與固相載體上的 5`羥基發(fā)生反應，形成亞磷酸三酯鍵。目前常用的方法是固相亞磷酸三酯法。 實例：基因組文庫 DNA → 轉化釀酒酵母細胞（ leu2, Leu） → 轉化細胞（ leu2/LEU2， Leu+） →LEU2 基因 基因組文庫 DNA → 轉化 （無纖維素酶活性） → 轉化細胞可在纖維素平板上形成水解圈 → 纖維素酶基因 10 核酸雜交法（同源序列克隆法）： （ 1) 原理 利用核酸探針與待分離 DNA的同源序列可進行雜交的特點分離目的基因。 8 篩選基因文庫的方法： ① 已知基因序列 ， 可以人工合成核酸探針 ， 通過核酸雜交 ， 從基因文庫中篩選出含目的基因的克隆 。利用多肽鏈制備的抗體及二抗，與多聚核糖核蛋白體一起溫育，目的基因的多聚核糖核蛋白體將通過抗原抗體反應與相應抗體形成復合物，利用不連續(xù)蔗糖梯度離心將此復合物分離出來，再通過酚 /仿抽提法出去蛋白質(zhì)部分，過oligodT柱層析，即可分離出特定蛋白編碼的 mRNA，反轉錄即可得到 cDNA。 制備目的基因要根據(jù)需要獲得 DNA片段，可能是啟動子、終止子、內(nèi)含子，或者是編碼某種蛋白完整的序列。 2 第一節(jié) 目的基因的制備 3 目的基因（ Target Gene） ：指基因工程中需要進行制備、克隆或利用的基因。 （ 3）分子雜交法 利用 DNA單鏈易與互補鏈形成雙鏈的原理，將已知基因 DNA與目的生物的 DNA進行復性，再用單鏈核酸酶S1酶切除單鏈，留下的雙鏈即為目的基因序列 5 基因翻譯過程中，核糖體沿 mRNA進行多肽鏈合