動物組織與胚胎工程(2)(存儲版)
【正文】 ? 一步冷凍法 省去了洗脫冷凍保護(hù)劑，其主要特點(diǎn)是冷凍細(xì)管里的冷凍液和稀釋液是分開的。 第二種是利用卵裂球或細(xì)胞與胚胎聚合，將胚胎卵裂球解離或用其他游離的細(xì)胞，與胚胎聚合。注射時，選取健康、生長良好的細(xì)胞。一般選用膚色、毛色差異明顯的動物的胚胎作為供體胚，如用白鼠或黑鼠。與標(biāo)準(zhǔn)的同工酶譜對照，鑒定是否是嵌合體。根據(jù)胚胎的直徑，制作適宜口徑的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。 ? 切割之前需要對其進(jìn)行軟化處理，處理標(biāo)準(zhǔn)是： 4－ 8細(xì)胞胚胎用 ％酶液處理 1－ 2分鐘；桑椹胚用 ％－ ％酶液處理 30秒鐘；囊胚則用 ％－％酶液處理 30秒以下。 過程 胚胎分割 。依照同樣的方法，可以將胚胎分割成為四或八分胚。 ? 對研究卵裂球位置與分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遺傳性等，都是一種很有用的技術(shù)。 經(jīng) GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)短期培養(yǎng)后，可以恢復(fù)正常狀態(tài)。 囊胚注射法 把某些種類細(xì)胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，甚至是已經(jīng)分化的細(xì)胞。讓一個胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機(jī)械壓力和 PHA的作用，更易聚合。該方法能較好地克服胚胎脫水少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成之間的矛盾，獲得較高的存活率。 動物胚胎的一般保存程序 ? 動物胚胎的一般保存程序是將胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷卻到 0℃ ，逐漸加入冷凍保護(hù)劑，封閉安瓿。 ? 快速冷凍時，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，對細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機(jī)械性損害，這是指冷凍的物理損傷。一般而言，經(jīng)過 48小時體外保存，再移向受體，胎兒的發(fā)育率要下降 50％，保存時間越長發(fā)育率越下降。然后，通過胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。 ? 揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。 – 羊：每日肌注孕酮 10~20mg， 或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮 50~60mg， 綿羊處理 12~14天 ， 山羊處理 12~18天 ， 在處理的最后一天或撤除海綿栓的前一天 ，給予 PMSG200~250IU， 一般可在停止注射或撤除海綿栓后 2~3天內(nèi)發(fā)情 。 其它方面應(yīng)用 ? 胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程 ? 體外受精必須借助胚胎移植實(shí)現(xiàn) “ 試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育 ? 轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植 （二） 胚胎移植的生理基礎(chǔ)及原則 ? ? ? 成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)十?dāng)?shù)個 ? 每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育 ? 早期胚胎處于游離狀態(tài) ? 胚胎發(fā)育不存在免疫問題 ? 胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系 ? 胚胎的遺傳性不受受體的影響 2. 胚胎移植的基本原則 ? 胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性 – 供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性 – 動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性 – 動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性 ? 胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi) ? 胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響 （三）、胚胎移植的技術(shù)程序 ? ? 2. 超數(shù)排卵處理 ? ? ? ? ? ? ? 供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價值 ? 供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后 60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強(qiáng)健 ? 受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強(qiáng)，體型中上等，非優(yōu)良品種 ? 受體健康狀況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié) ? 供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致 2. 超數(shù)排卵處理 ? 利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵（ superovulation） ? 意義：讓每個供體提供更多的胚胎 ? 處理時間： – 牛：預(yù)計自然發(fā)情時間的前 4天，或發(fā)情周期的第 1617天 – 羊：發(fā)情周期的第 1215天，促性腺激素處理的第二天或第三天，注射 PG 同期發(fā)情與超排程序 放栓 發(fā)情鑒定 配種 0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 7:00 FSH 4ml 18:00 FSH 4 ml 7:00 FSH 18:00 FSH 7:00 FSH 2ml 14:00 PG 6ml 18:00 FSH 2ml 7:00 FSH 14:00 取栓 18:00 FSH 配種 配種 檢查黃體 沖胚移胚 ? 1）母牛發(fā)情后 9— 13天開始肌肉注射促卵泡素 (FSH)， 每次劑量為 50IU， 每天兩次，每次間隔 12h， 連續(xù)注射 4天，共 8次。 ? 通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（ multiple ovulation and embry
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