db51t1203-20xx馬鈴薯m病毒、馬鈴薯s病毒檢疫鑒定技術規(guī)程doc(存儲版)
【正文】 毒粒體線形，長650nm，病汁液稀釋限點1～10倍，鈍化溫度55～60℃，體外存活期3～4天。在田間該病毒傳播很快，傳播范圍廣，既可通過葉片接觸傳播，也可通過蚜蟲傳播，種植一季后感染率可高達70%，可使馬鈴薯減產1020%?！?點樣用移液器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應板孔內，每個樣品三次重復，每孔100μL。 洗板 。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應孔中殘留液體。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應孔中殘留液體?！?結果測定和記錄用酶聯(lián)檢測儀測定并記錄光密度值（OD值）。L去蛋白液RW1，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。 馬鈴薯M病毒RT反應體系反應物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無RNA酶的ddH2O加入量（181。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min。L）11414 反應程序 反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 sec，59 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。 XIV?！?PCR反應 反應體系。L的溴酚藍上樣緩沖液混勻，以及2 181。L無RNA酶的雙蒸水，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，得到RNA溶液?；靹颍玫降娜芤汉统恋硪黄疝D入CR吸附柱中，12000 rpm離心1 min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中?！?終止反應顯色后在每孔中加入50 μL 終止液。 洗板在每個反應孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3 min后將洗滌液迅速倒出。CC附 錄 C （資料性附錄）馬鈴薯S病毒DASELISA檢驗程序 包被抗體 包被向酶聯(lián)反應板每孔加入100 μL用包被緩沖液稀釋的PVS捕捉抗體，將酶聯(lián)反應板置于保濕容器中，室溫孵育4 h 或4 ℃冰箱過夜?！?結合酶標抗體 加酶標抗體向酶聯(lián)反應板每孔加入100 μL用PVM酶標抗體稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標抗體溶液?！?點樣 樣品制備將待測樣品剪碎， g于研缽中，加入1 mL樣品提取液充分研磨后，再加入2 mL樣品提取液充分研磨至均勻。PVM和同屬的PVS常常同時在馬鈴薯植株中存在?！?馬鈴薯S病毒 potato virus S簡稱PVS。9 結果判定 DAS－ELISA在陰性對照OD值≤，且陽性對照OD值大于陰性對照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對照OD值2倍時，判定為陽性反應，即樣品帶相應的被檢病毒；否則判定為陰性反應，即樣品不帶相應的被檢病毒。8 實驗室檢驗 DAS－ELISA 馬鈴薯M病毒檢驗方法見附錄B?！?引物 PVM上游引物（P1）堿基序列: 5＇ CGCATACAATATCTGGACTTACAC3＇，下游引物（P2）堿基序列: 5＇CTACTCCAGTAATGCAACTCATC3＇，用雙蒸水稀釋至20μM?！?RL裂解液?！?RTPCR檢驗試劑 莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶（MMLV） 100 U/μl?！?包被緩沖液（Coating buffer） g碳酸氫鈉（NaHCO3）、 g碳酸鈉（Na2CO3）、 g疊氮化鈉（NaN3），用1000 mL蒸餾水溶解，貯藏于4℃條件下備用?！?免疫學檢驗試劑 捕捉抗體（Capture antibody） 馬鈴薯M病毒免疫球蛋白，抗體稀釋度按市售產品要求進行。GB155692009 農業(yè)植物調運檢
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