【正文】 提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)進(jìn)行預(yù)熱，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。8. 及時(shí)完善實(shí)驗(yàn)室記錄。6. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出準(zhǔn)備好的卵裂培養(yǎng)液微滴的皿，標(biāo)記患者姓名和皿號(hào)，和另一個(gè)工作人員核對(duì)無(wú)誤。3. 提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。8. 準(zhǔn)備ICSI操作皿（Falcon 1006）：在皿底和皿蓋標(biāo)記好患者姓名。將盛有卵子的操作皿放置于調(diào)好的顯微鏡操作儀的熱臺(tái)上；10物鏡下調(diào)節(jié)顯微鏡焦距使操作皿內(nèi)微滴的邊緣清晰可見。14. 重復(fù)上述步驟至所有的成熟卵子都注射完畢，將ICSI皿從顯微鏡熱板轉(zhuǎn)移至解剖鏡下，從培養(yǎng)箱取出卵裂培養(yǎng)皿，每個(gè)卵子在培養(yǎng)皿中央兩個(gè)液滴中漂洗數(shù)次，再轉(zhuǎn)移至旁邊微滴中放回培養(yǎng)箱。卵細(xì)胞呈淺透明狀，放射冠完全沒(méi)有分開，卵丘細(xì)胞緊密排列，顏色偏淺或卵丘細(xì)胞團(tuán)很小。此時(shí)胞漿中看不到細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，在卵黃間隙中可見第一極體。C：無(wú)彈性。（三） 卵裂期胚胎評(píng)分I級(jí)：細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則；胞質(zhì)均勻清晰，沒(méi)有顆?，F(xiàn)象；碎片在0－5％之間。5期：正在孵出囊胚，滋養(yǎng)外胚層通過(guò)透明帶向外凸出。 20％，大小比較均勻；4. Day56（授精后112140小時(shí)）：3BB及以上。（3） 采用連續(xù)評(píng)分法挑選，即綜合原核評(píng)分和胚胎形態(tài)評(píng)分，挑選形原核評(píng)分高、形態(tài)好、碎片少、無(wú)空泡的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。如果有胚胎殘留，必須用一根干凈的移植管重新裝入，重新移植。將裝入胚胎的培養(yǎng)皿放入37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2. 取1個(gè)四孔板，在蓋子上標(biāo)記ES、VS液，每孔各加400ml。在此過(guò)程中，胚胎會(huì)出現(xiàn)皺縮并隨即膨脹，當(dāng)其復(fù)膨到最大程度（至少80%）時(shí)，即達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)迅速將胚胎移入VS孔中（注意：400ml微滴可在等待胚胎平衡時(shí)制作）。1. 培養(yǎng)液準(zhǔn)備：冷凍胚胎復(fù)蘇的前一日，用囊胚培養(yǎng)液準(zhǔn)備胚胎培養(yǎng)皿，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過(guò)夜。9. 將洗滌后的胚胎轉(zhuǎn)入另一囊胚培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，在皿蓋上標(biāo)記患者姓名，另一實(shí)驗(yàn)室人員核對(duì)，顯微鏡下觀察后放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。2. 把裝有胚胎的培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡載物臺(tái)上，將焦距調(diào)節(jié)清晰。7. 清潔操作區(qū)域。同時(shí)此類助孕者的胚胎質(zhì)量往往不如年輕者；2. IVF治療史：有IVF治療失敗史，在排除子宮內(nèi)膜，胚胎質(zhì)量等明顯影響其植入的因素后，在再次IVF時(shí)應(yīng)做輔助孵化，因?yàn)槟遗卟荒芊醭隹赡苁侵踩胧〉脑颍?. 透明帶異常：當(dāng)出現(xiàn)胚胎透明帶異常，如形態(tài)不規(guī)則，呈橢圓形，或透明帶著色深，或透明帶厚度增厚（≥15mm），均提示透明帶異常，或有某種功能上的缺陷需做輔助孵化；4. 胚胎碎片率＞20％：在沒(méi)有優(yōu)質(zhì)胚胎可供選擇的前提下，當(dāng)胚胎出現(xiàn)較多碎片時(shí)，通過(guò)輔助孵化使碎片流出，可能有助于胚胎發(fā)育和孵化；5. 基礎(chǔ)FSH升高（≥15mIU/ml）：FSH基礎(chǔ)水平升高常提示卵巢功能較差，卵子的透明帶可能出現(xiàn)異常；6. 胚胎或卵子冷凍復(fù)蘇后。7. 將胚胎移入WSWS2各放置5分鐘（室溫）。11. 完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室記錄。注意以下操作均為室溫下進(jìn)行。八、 胚胎的玻璃化冷凍以下操作流程為卵裂期胚胎為例，卵子與囊胚的玻璃化冷凍操作可參考此流程。3. 拉針：取一根巴斯德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管。（3） 將裝好胚胎的移植管平穩(wěn)的拿到臨床手術(shù)室，再次核對(duì)患者夫婦姓名，確認(rèn)無(wú)誤后緩慢的插入外管內(nèi)， cm處，調(diào)整好后，緩慢平穩(wěn)的推動(dòng)注射器，將內(nèi)管內(nèi)胚胎及移植液注入患者子宮，注射器推至末端，停留30秒后退出內(nèi)外管。（2） 胚胎移植后若有剩余胚胎，應(yīng)征求患者對(duì)剩余胚胎的處理意見并簽署《配子與胚胎去向知情同意書》。（七） 優(yōu)質(zhì)胚胎定義1. Day1為2pn；2. Day2（授精后4044小時(shí)）：2－5細(xì)胞，碎片163。3期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積。3. 原核的出現(xiàn)和消失是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，不同的時(shí)間評(píng)估可能會(huì)有不同的結(jié)果。B：破膜困難。卵細(xì)胞顏色變深，放射冠分散，但外周的卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失。（6） ICSI操作時(shí)動(dòng)作要輕柔快速，從制動(dòng)精子至精子被注入一枚卵子胞質(zhì)中的時(shí)間宜控制在3分鐘內(nèi)。調(diào)節(jié)顯微操作針和卵膜至同一水平面，將精子推至注射針尖處，于3點(diǎn)鐘處垂直穿過(guò)透明帶并繼續(xù)進(jìn)針，至卵中心或越過(guò)中心位置（卵母細(xì)胞直徑的5075%），輕微回吸注射針，當(dāng)胞漿和精子出現(xiàn)快速返流的過(guò)程，指示卵膜已破，停止回吸，將精子緩慢注入卵子胞質(zhì)內(nèi)，緩慢退出注射針。10. 將持卵針和注射針升高，確保操作臺(tái)與熱臺(tái)之間的高度能夠輕松放置操作皿而不碰及操作針。6. 用原口徑巴斯德吸管將不多于8個(gè)OCCC移入含透明質(zhì)酸酶的孔中沖洗吸打3060秒，至外層顆粒細(xì)胞脫去后，用稍粗口徑吸管將卵子移入GMOPS Plus中。取卵前一天下午根據(jù)卵泡數(shù)量準(zhǔn)備剝卵用培養(yǎng)液GMOPS Plus，加入Falcon 2001圓底試管中，蓋緊蓋子，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)平衡。4. 用稍粗的巴斯德吸管將卵子轉(zhuǎn)移到剝卵皿液滴，再用稍細(xì)的巴斯德吸管吹吸受精卵數(shù)次，盡量除去顆粒細(xì)胞直至可清晰觀察受精卵。6. 用移液器吸出適量精子，在遠(yuǎn)離卵子處將精子懸液加入受精皿。7. 取卵過(guò)程如發(fā)現(xiàn)異常，如未見卵母細(xì)胞，獲取數(shù)明顯少于卵泡數(shù)，及時(shí)與醫(yī)生溝通。3. 檢查已平衡好的培養(yǎng)液，包括沖管液，洗卵培養(yǎng)液和受精培養(yǎng)液。二、 撿卵操作常規(guī)(一) 撿卵前配液準(zhǔn)備1. 配液在取卵前一天進(jìn)行。5. 睪丸穿刺前準(zhǔn)備一個(gè)小皿，加入2ml GIVF Plus給醫(yī)生。6. 反復(fù)穿刺未果，由臨床醫(yī)生決定是否改行TESA。由于尿量很多，所以需要500g離心10分鐘。2. 患者在取精24小時(shí)之前服用小蘇打片。（五） 精液復(fù)蘇操作常規(guī)1. 試劑和耗材準(zhǔn)備精液處理的常規(guī)試劑盒耗材，37攝氏度水浴鍋，溫度計(jì)等2. 步驟（1） 查找需要復(fù)蘇的精液標(biāo)本，從液氮罐中取出標(biāo)本，核對(duì)凍存管上的信息。 （四）精液冷凍操作常規(guī)對(duì)于部分取精困難，或者因其他原因未能在取卵當(dāng)日取得精液患者，可采取提前冷凍精液于液氮中的方法將標(biāo)本保存以作為取卵日備用，以免耽誤取卵日授精時(shí)機(jī)。（3） 把稀釋的精液標(biāo)本放入離心管內(nèi)，每管不超過(guò)4ml。 微量梯度離心法（1） 45%密度梯度離心液于15ml無(wú)菌的圓錐底試管中。（5） 200g離心5分鐘。3. 每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基GIVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。（2） 告知患者使用避孕套方法以及如何將樣本轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)記錄樣本采集的時(shí)間，應(yīng)在采集后1小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。（3） 護(hù)士核對(duì)患者夫婦姓名、有效證件后，在取精杯杯身及杯蓋上標(biāo)記患者夫婦姓名及病歷號(hào)。四、 實(shí)驗(yàn)室新人培訓(xùn)計(jì)劃1. 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須具備醫(yī)學(xué)或生物學(xué)專業(yè)本科以上學(xué)歷，并掌握系統(tǒng)的臨床胚胎學(xué)知識(shí)和細(xì)胞培養(yǎng)技能。其它故障立即報(bào)修。對(duì)于受主觀因素影響較大項(xiàng)目，應(yīng)該進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量控制檢查，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的操作的準(zhǔn)確性和精確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果小于85%，應(yīng)考慮可能有細(xì)胞毒素的存在。（3） 對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有疑問(wèn)時(shí)，立即停止使用并報(bào)告質(zhì)控科。（2） 保存：所有培養(yǎng)液在規(guī)定條件下保存至有效期?！?。如遇特殊情況，及時(shí)更換。4. 液氮罐應(yīng)每3年進(jìn)行一次校驗(yàn)。每天記錄氣瓶的壓力，定期檢查氣瓶有無(wú)漏氣并更換培養(yǎng)箱外氣體過(guò)濾器。培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤使用超純水，根據(jù)不同培養(yǎng)箱要求定期更換，換水當(dāng)天培養(yǎng)箱不放卵子或胚胎；4. 培養(yǎng)箱顯示器溫度與培養(yǎng)箱內(nèi)溫度計(jì)的溫度應(yīng)一致。10. 在實(shí)驗(yàn)室體液操作中必須使用機(jī)械抽吸裝置，禁止用口吸。3. 特別小心不要被那些受體液污染的儀器或設(shè)備意外損傷。2. 實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接種。9. 因體液溢出污染實(shí)驗(yàn)室設(shè)備時(shí)，應(yīng)在操作完成后用75%酒精消毒?！妫?. 濕度：大于80%RH，水盤內(nèi)水的深度始終保持在大約1cm 以上。2. 使用醫(yī)用高純度CO2（%以上）培養(yǎng)胚胎。3. 液氮罐應(yīng)存放于固定位置。3. 實(shí)驗(yàn)室凈化空調(diào)系統(tǒng)由專業(yè)人士檢測(cè)維護(hù)，新風(fēng)口濾網(wǎng)每24周更換一次，回風(fēng)口濾網(wǎng)每月更換一次，初效過(guò)濾器每13個(gè)月更換一次，中效過(guò)濾器每36個(gè)月更換一次，高效過(guò)濾器每12年更換一次，并做好維護(hù)檢測(cè)記錄。要求：38℃177。1. 培養(yǎng)基管理（1） 登記：培養(yǎng)基到貨時(shí)需立即清點(diǎn)、核對(duì)、記錄到貨時(shí)間、試劑名稱、編號(hào)、批號(hào)、數(shù)量、收貨人等，并注明冷藏品到貨時(shí)，包裝和儲(chǔ)存條件是否達(dá)到要求。所有耗材送至實(shí)驗(yàn)室之前，必須用75%乙醇擦拭外包裝，待75%乙醇揮發(fā)后放入物品柜。正常生存指數(shù)應(yīng)大于85%。2. 應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室每位成員進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督，避免由于儀器、試劑、個(gè)人操作引起的偏差。3. 顯微鏡：準(zhǔn)備燈泡與保險(xiǎn)絲的備件，出現(xiàn)故障時(shí)及時(shí)更換。(四) 一次性耗材按常規(guī)進(jìn)行質(zhì)控，一旦出現(xiàn)異常，立即更換批號(hào)。（2） 精液需經(jīng)手淫法收集到一次性無(wú)菌無(wú)毒的干燥容器內(nèi)，強(qiáng)調(diào)樣本收集必須完整，確認(rèn)是否取精困難，并告訴患者如何運(yùn)送精液標(biāo)本。3. 用避孕套采集樣本（1） 對(duì)于通過(guò)手淫法采集精液困難者，則采用特制的避孕套通過(guò)性交法獲取精液。（2） 觀察精液的粘液絲，精子的凝集及非精子細(xì)胞（包括上皮細(xì)胞，圓形細(xì)胞及斷裂的精子頭或尾部）（3） 評(píng)估精子的密度（4）