【正文】 法：通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5p以抑制DNA的自我環(huán)化。TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因DNA的同時(shí), 能不依賴模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩3’端加個(gè)游離的“A”。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)菌）從周圍介質(zhì)中吸收來(lái)自另一種基因型細(xì)胞的DNA, 進(jìn)而使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。Hfr株系不穩(wěn)定，F(xiàn)質(zhì)?？砂l(fā)生接合傳遞質(zhì)粒DNA, F+菌株可失去F質(zhì)粒, F－菌也可獲得F質(zhì)粒, 其轉(zhuǎn)移難以人為控制,又不穩(wěn)定， 通常不用作克隆載體。（2）酶切鑒定：對(duì)于篩選出的具有重組子的菌株，經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組載體DNA，根據(jù)已知重組時(shí)外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，就可以看出載體中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker條帶對(duì)比分析可得知插入基因片段的大小。如賴氨酸的密碼子AAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG,使肽鏈合成過(guò)早終止, 因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般沒(méi)有活性。在G1期停止走向終末分化。末期后分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，結(jié)束M期。破壞PARP修復(fù)DNA功能，引起細(xì)胞凋亡。(四)熒光法：斷裂DNA可被DAPI著色后形成核斷裂顆粒熒光。（七）Bcl2/Bax基因表達(dá)檢測(cè)：提取細(xì)胞mRNA→加逆轉(zhuǎn)錄酶→加入引物，Taq酶→PCR擴(kuò)增→cDNA→定量檢測(cè)cDNA量。第二階段，激動(dòng)劑分子與受體結(jié)合，使受體的構(gòu)象變得易于與G蛋白結(jié)合。2.2 試述受體作用的特點(diǎn) 答：1 高度專一性，受體選擇性的與特定的配體結(jié)合。一旦突變失活就失去了對(duì)癌基因活化的負(fù)調(diào)控作用，以利癌基因啟動(dòng)活化而引起腫瘤。原癌基因異常激活后的致癌作用是通過(guò)其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，大致分類如下：1 生長(zhǎng)因子類的癌蛋白，2 生長(zhǎng)因子受體類的癌蛋白，3 蛋白激酶類癌蛋白，4 GTP酶類的癌蛋白，5 表達(dá)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的癌蛋白，6 表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl2癌蛋白。即使致病基因的突變序列糾正為正常序列（用堿基點(diǎn)突變技術(shù)）。反基因療法：采用反義技術(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上阻斷腫瘤細(xì)胞中異?；虻谋磉_(dá)，從而引起細(xì)胞的凋亡。它們可以持續(xù)地將人們所希望的蛋白質(zhì)基因表達(dá)出蛋白質(zhì)。問(wèn)答：？舉例說(shuō)明之答：所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就是把外源性目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或其囊胚細(xì)胞中，后改用注入受精卵的任何一個(gè)前核，并在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細(xì)胞篩選出來(lái)，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動(dòng)物（foster mother）的子宮內(nèi), 使之發(fā)育成具表達(dá)目的基因的胚胎動(dòng)物, 并能傳給下一代。經(jīng)過(guò)核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。我國(guó)反對(duì)克隆人，但不反對(duì)克隆有醫(yī)用價(jià)值的人體器官，主張?jiān)诳刂茥l件下，有序進(jìn)行。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎?；蚯贸菏窍蛘Ｉ飩€(gè)體內(nèi)引入某個(gè)突變基因位點(diǎn)而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù)，可培養(yǎng)出靶向性剔除某基因的小鼠，而導(dǎo)致行為特性改變。這時(shí)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺就成為一個(gè)為生產(chǎn)某種生物活性蛋白的生物反應(yīng)器（乳腺反應(yīng)器）。核酶反義RNA：具核酶（ribogyme）活性的反義RNA，它既能與mRNA互補(bǔ)結(jié)合阻止mRNA的翻譯，同時(shí)反義RNA上帶有錘頭狀結(jié)構(gòu)基因能對(duì)靶序列（mRNA）進(jìn)行特異性切割，建立了核酶基因治療新技術(shù)。但操作難度大，有倫理學(xué)問(wèn)題。 原癌基因是不致癌的，但當(dāng)原癌基因在結(jié)構(gòu)上或其調(diào)控系統(tǒng)受到致癌因子的干擾或合抑癌基因的突變或缺失后，原癌基因被異常激活，使正常細(xì)胞發(fā)生惡變，可能的機(jī)制有：1 基因突變，2 基因擴(kuò)增，3 染色體易位和基因重排，4 病毒之間的相互作用5病毒的啟動(dòng)因子插入。2 Conc：在RV病毒基因組中有一個(gè)具有致癌活性的SRC基因片段，人們將存在于正常組織與Vonc同源的基因序列統(tǒng)稱為Conc，即原癌基因。5.G蛋白中介的反應(yīng)可分為四個(gè)階段：第一階段為靜止態(tài)。加Bcl2抗體，洗滌后加酶標(biāo)二抗→顯色→鏡檢。3 細(xì)胞凋亡常用哪幾種特異檢測(cè)方法來(lái)證明細(xì)胞凋亡？答：(一）光鏡的形態(tài)學(xué)觀察：普通光鏡：細(xì)胞園縮，核濃縮、破碎 透射光鏡：凋亡小體（二）細(xì)胞DNA提取物的核酸電泳：電泳后經(jīng)過(guò)溴乙錠染色，在紫外光下呈梯形條帶。3 AP峰：即凋亡峰，經(jīng)DAPI即46二脒基二苯基吲哚熒光染色，可見(jiàn)顆粒狀的熒光碎片(核內(nèi))，在流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)可測(cè)出亞G1峰，稱“G1”期的AP峰。中期。G1控制點(diǎn)：在G1期哺乳動(dòng)物細(xì)胞趨向有三種可能性⒈連續(xù)分裂細(xì)胞不斷突破G1期至S期。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔?。在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個(gè)抗性基因，就會(huì)導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個(gè)分別含不同抗生素藥物的平板進(jìn)行對(duì)照篩選，可篩選出陽(yáng)性重組子克隆菌體。二、通過(guò)接合作用傳遞質(zhì)粒DNA：質(zhì)粒由F+向F－菌的轉(zhuǎn)移過(guò)程叫接合作用傳遞質(zhì)粒, 又稱質(zhì)粒的接合傳遞。使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)化方法有：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法4 α互補(bǔ)：原理：所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無(wú)β半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過(guò)α肽互補(bǔ)作用可呈現(xiàn)有功能的β半乳糖苷酶活性, 進(jìn)而可分解底物Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍(lán)色的底物5溴4氯青定藍(lán), 使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。 6 試述TA克隆法的原理和用途。常用載體是質(zhì)粒（λ噬菌體）。第一個(gè)核苷酸固定于不溶性的固相載體上, 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開(kāi)始，以3’、5’磷酸二酯鍵與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團(tuán) ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物, 再用同樣的步驟與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng), 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來(lái), 解除保護(hù)基, 進(jìn)一步純化。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或消除原有的酶切位點(diǎn)）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。2.(3)用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平切口或粘性末端。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如[a32P] dNTP，則隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。比如在針對(duì)支原體，螺旋體，衣原體，幽門螺旋桿菌等不易生長(zhǎng)的細(xì)菌檢測(cè)。三，致病病毒的檢測(cè)：檢測(cè)HIV，HBV,HSV單純皰疹病毒,HPV人乳頭病毒,等。9 Western印跡:一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，將蛋白質(zhì)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固體載體上，然后加入抗體形成抗原抗體復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將 結(jié)果顯示到膜或底片上。4原位PCR：直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點(diǎn)。為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶有3/OH的單鏈延伸，需要用5/特異的核酸外切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個(gè)末端核苷酸。同時(shí)還有其他一些如巰基試劑、適宜PH值、甘油體積分?jǐn)?shù)等對(duì)不同的內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)要求也不同2 如何實(shí)現(xiàn)DNA粘性末端連接?單酶切點(diǎn)的連接如何降低本底和克服自我環(huán)化？答：用同一限制性內(nèi)切酶對(duì)載體及外源DNA作相同消化，隨后把這兩種DNA混合起來(lái)，加入DNA連接酶，便可產(chǎn)生出穩(wěn)定的雜種DNA。不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。問(wèn)答：1 影響Ⅱ型核算內(nèi)切酶活性的因素有哪些？如何克服？答：一、DNA的純度。 3 同裂酶：識(shí)別序列相同，對(duì)甲基化切點(diǎn)敏感性不同的兩種酶 。三，真核生物可以在需要時(shí)可以重排某些DNA片段和擴(kuò)增特定基因的機(jī)制，而原核生物沒(méi)有。四：反式作用元件在合成過(guò)程中有相當(dāng)大的可變性和可塑性。 2 亮氨酸拉鏈：存在與蛋白C末端，—螺旋形成的對(duì)稱二聚體，約為30個(gè)氨基酸，每?jī)蓚€(gè)亮氨酸之間隔有六個(gè)氨基酸，于是每?jī)扇β菪陀幸粋€(gè)亮氨酸，排成一排，從而在2個(gè)α螺旋的蛋白分子之間形成一條拉鏈。4 起始密碼子：編碼多肽鏈的第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。后果：可以在細(xì)菌染色體或質(zhì)粒中隨機(jī)轉(zhuǎn)移，被插入的基因即失去活性。一般510bp短序列，人類為171bp，保護(hù)和穩(wěn)定染色體7 基因組：表示某物種單倍體的總DNA。應(yīng)用前景：大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的應(yīng)用；用于基因治療；基因表達(dá)的調(diào)控。？其功能和醫(yī)學(xué)意義如何？答：又稱為調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，也即堿基序列與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA分子。：小核RNA，只存在于細(xì)胞核或者核質(zhì)核仁中的一類小分子量的RNA，具有獨(dú)特功能并且獨(dú)立存在的實(shí)體，約為70300個(gè)核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源RNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。起始階段Dicer酶以依賴ATP的方式切割外源性的雙鏈RNA為小分子干擾RNA，清除病毒，阻斷轉(zhuǎn)座子表達(dá)；效應(yīng)階段小分子干擾RNA結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)活化的復(fù)合物及RISC，然后RISC結(jié)合至mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割它，從而發(fā)揮作用。6 衛(wèi)星DNA：又稱隨體DNA,不編碼蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄RNA的小片段高度重復(fù)一類小片段DNA序列，多富含GC堿基在DNA浮力密度實(shí)驗(yàn)中會(huì)在主峰旁形成些小峰，形似衛(wèi)星分布而稱之。轉(zhuǎn)位作用：轉(zhuǎn)位子具有雙向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位點(diǎn)上的移動(dòng)方式。3 終止子：位于一個(gè)基因編碼區(qū)下游提供終止信號(hào)的DNA序列，可以被RNA聚合酶識(shí)別并發(fā)出停止mRNA合成的信號(hào)。第四章名詞解釋：1 鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)組氨酸殘基通過(guò)位于中心的鋅離子結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。三：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)DNA的結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象上細(xì)微的改變，從而發(fā)揮調(diào)控作用。二，真核生物DNA都有內(nèi)含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。2 同尾酶：有一些限