【正文】 在過度生長的腫瘤組織中，由于腫瘤細(xì)胞生長速度快于形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏的區(qū)域，而缺氧條件可以通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)；如果采用缺氧響應(yīng)元件(HRE)來控制治療基因的表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理n 四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。從基因操作的角度來看，腫瘤基因治療則主要有四大策略，即基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。費(fèi)城染色體(phˊ) bcrabl融合基因的連接處是反義封閉的最佳位置。修飾主要針對反義寡核苷酸的磷酸骨架，可采用硫原子或甲基基團(tuán)代替磷酸二酯中帶負(fù)電的氧原子，提高對核酸酶的耐受力。 自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。主要包括細(xì)胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類。目前除了開發(fā)針對腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的拮抗劑，如用于阻斷P糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成的丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。（2）將能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，插入表達(dá)載體后直接導(dǎo)入機(jī)體，表達(dá)的抗原不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，還可以引發(fā)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生對野生致病病毒攻擊的防御作用。神經(jīng)母細(xì)胞（neuroprogenitor）和人星型膠質(zhì)細(xì)胞明顯可以作為自體同源的細(xì)胞載體用于ex vivo修飾和擴(kuò)張。八、參考文獻(xiàn)：1. Robert F. Weaver編著. 《Molecular Biology》(第二版). 北京：科學(xué)出版社. 2002 2．Leland H. Hartwell 等編著. 《Genetics:from genes to genomes》. 北京：科學(xué)出版社. 20033. Sambrook and Ruussell編著. 《Molecular Cloning》(第三版). 西安：世界圖書出版公司. 20024. 胡維新主編.《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》長沙：中南大學(xué)出版社. 20015．Timothy M. Cox amp。四、其他疾病的基因治療研究 神經(jīng)退化性疾?。ㄈ缗两鹕喜。?由于腺病毒可以感染有絲分裂后的細(xì)胞，同時具有潛在的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫特惠區(qū)（immunologically privileged site）中的低病原性，因此是進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的有效載體。迄今為止，臨床上對絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，而在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。 (2)耐藥基因治療：在解決化療所致骨髓細(xì)胞造血功能受到嚴(yán)重抑制的問題方面，通過向腫瘤患者的骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr1基因等，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。這種效應(yīng)明顯擴(kuò)大了“自殺基因”的殺傷作用，大大放寬了對基因轉(zhuǎn)移效率的限制，對于自殺基因治療的發(fā)展具有重要意義。目前研究較多的“自殺基因”有單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，它編碼的胸腺嘧啶激酶可以將無毒的核苷類似物──丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）磷酸化為細(xì)胞毒性物質(zhì)。RNA干擾技術(shù)在惡性腫瘤的基因治療中顯示了美好的前景。 （1）反義RNA技術(shù)：反義RNA的獲得可通過體外構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體，導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞表達(dá)反義RNA，也可體外合成反義RNA，導(dǎo)入靶細(xì)胞，直接對表達(dá)異常的癌基因產(chǎn)生抑制效應(yīng)。(2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。在此后十幾年中，基因治療在臨床上的試驗(yàn)和應(yīng)用越來越多。原理：大腸桿菌四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受到Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，在沒有四環(huán)素存在的條件下，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合從而阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)；而當(dāng)四環(huán)素存在的時候，由于阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，從而使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵御應(yīng)激。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細(xì)胞中含量很高，采用其啟動子驅(qū)動治療基因，可以使治療基因只在CEA陽性的癌細(xì)胞中表達(dá)，而不會在陰性細(xì)胞中表達(dá)?；蛘{(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。七、其它細(xì)胞許多實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞也是基因治療較為常用的細(xì)胞類型，除了肝細(xì)胞外，還有心肌細(xì)胞和脾細(xì)胞。用含β半乳糖苷酶基因的真核表達(dá)質(zhì)粒直接注射入小鼠骨骼肌，在注射區(qū)域的肌細(xì)胞可以檢測到該基因的表達(dá)。三、血管內(nèi)皮細(xì)胞將基因?qū)胙軆?nèi)皮細(xì)胞，可以直接向血液中分泌基因表達(dá)產(chǎn)物。一、 造血細(xì)胞造血組織細(xì)胞在體內(nèi)多處分布，有較多的遺傳病與造血組織相關(guān)，骨髓移植方法已經(jīng)建立，使造血細(xì)胞成為基因治療中最重要的受體細(xì)胞。這種抑制作用，對于腫瘤化療來說無疑是一個很好的輔助手段。靶基因的優(yōu)勢結(jié)合位點(diǎn)在15～40 堿基對的范圍內(nèi)，ODN通常結(jié)合到雙螺旋中同聚嘌吟（A和G）鏈上；形成三螺旋的ODN不干擾原有雙螺旋間的氫鍵，ODN中每個堿基與雙螺旋靶區(qū)中的嘌呤堿基形成兩個新的氫鍵。（－） 三鏈DNA與基因表達(dá) ODN以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶標(biāo)，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止基因轉(zhuǎn)錄。在該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用中，存在著一個難題，由于 mRNA的拷貝數(shù)太多，難以達(dá)到完全的抑制。2. 核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥物的反應(yīng)性。（三）RNA干擾的應(yīng)用前景RNA干擾現(xiàn)象在生物界普遍存在，以及RNA干擾的作用機(jī)制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。siRNA一般不會在哺乳類細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾研究中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。例如：用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可以增強(qiáng)反義核酸的抗降解作用。ASGPPL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA通過這一途徑進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。反義RNA用于體內(nèi)基因治療，必須解決以下兩個關(guān)鍵問題。動物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射異體DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。圖示受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程。（非生物學(xué)方法）。AAV生命周期的特點(diǎn)：● 單獨(dú)不能進(jìn)行復(fù)制；以潛伏感染為主；● 病毒基因組與細(xì)胞共存；● 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；● 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因， AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制；● 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。 腺病毒的優(yōu)點(diǎn)：基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大， kb外源基因腺病毒載體缺點(diǎn)：1）不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。圖示逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR；（2）LTR由UR和U5三部分組成：在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動子； U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ；在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。ex vivo(經(jīng)活體)，即將靶細(xì)胞在體外導(dǎo)入外源基因及體外增殖、篩選、藥物處理或其他操作后，再輸回患者體內(nèi)。旁觀者效應(yīng)明顯地增強(qiáng)了自殺基因?qū)δ[瘤的殺傷作用，在相當(dāng)程度上彌補(bǔ)了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題。較常用的方法是采用反義核酸、核酶或者干擾RNA技術(shù)等抑制基因的表達(dá)。n 要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。 基因治療分類體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個體的當(dāng)代生殖細(xì)胞(germline)基因治療 對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第一節(jié) 基因治療的策略1．基因治療的概念定義：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對疾病起治療作用。中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心教 案授課科目: 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)授課內(nèi)容: 基因治療授課對象：臨床醫(yī)學(xué)七年制、八年制授課時數(shù)：4 學(xué)時授課教師：授課地點(diǎn)：湘雅醫(yī)學(xué)院新教學(xué)區(qū)授課時間：授課教材：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（21世紀(jì)高等院校教材），胡維新主編，北京：科學(xué)出版社，2007年2月，第一版；醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（衛(wèi)生部8年制規(guī)劃教材），馮作化主編，北京： 人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版一．目的要求掌握：基因治療的概念、基本策略、常用載體；治療基因的受控表達(dá)原理與方法。DNA重組、基因轉(zhuǎn)移、基因克隆和表達(dá)等技術(shù)的迅猛發(fā)展，為基因治療的飛速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。這樣，帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)進(jìn)行部分基因序列的交換。此類基因治療的靶基因往往是過度表達(dá)的癌基因或者是病毒的基因。腫瘤細(xì)胞的消除有賴于旁觀者效應(yīng)，即轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因可以影響沒有被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞。 第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)圖示基因治療的兩種途徑。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，即由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成環(huán)狀雙鏈DNA分子，并隨機(jī)整合至宿主細(xì)