各種疾病的分子基礎(chǔ)(存儲(chǔ)版)
【正文】 況， DNA與層析管柱結(jié)合的能力取決於 DNA的長(zhǎng)度 片段越大在管柱中留置的時(shí)間就愈長(zhǎng) 雜合雙鏈產(chǎn)物的產(chǎn)生方法 將 PCR 產(chǎn)物野生型和突變型以約 1 : 1混合 95176。端多加了 20 bp 以 Primer長(zhǎng)度不同或不同螢光染料來(lái)區(qū)分 靠近 3‘端多加一、二個(gè) mismatch的鹼基，以增加反應(yīng)的特異性 多個(gè)鹼基的改變會(huì)使引子與正?；蛲蛔冃蛄薪Y(jié)合的穩(wěn)定性不同，這樣就增加引子的特異性。然後將 8 ml樣本注入管柱 PCR產(chǎn)物分離條件 DNA片段的長(zhǎng)度及鹼基的組成 錯(cuò)配的雜合子在管柱上的時(shí)間會(huì)明顯下降 先找正常型的 DNA片段的實(shí)驗(yàn)條件 (管柱的溫度，及緩衝液濃度梯度 )，得知野生型標(biāo)準(zhǔn)圖譜 待測(cè)的樣品所跑出來(lái)的圖譜與正常的比較 建立各種突變的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，可藉此快速自動(dòng)化檢測(cè)疾病突變 跑出來(lái)的 peak有問(wèn)題，也可以進(jìn)行直接定序分析 DHPLC有許多優(yōu)點(diǎn)：自動(dòng)化操作，快速和靈敏度高，應(yīng)用於單基因突變的篩檢可以在短時(shí)間內(nèi)分析大量的樣品 化學(xué)特性 錯(cuò)配鹼基化學(xué)切斷法 Chemical cleavage of mismatch, CCM 將篩檢的 PCR產(chǎn)物混合，形成異源雜合雙鏈 錯(cuò)配的雜合 DNA上的 C和 T可使用羥胺hydroxylamine及四氧化鋨 osmium tetroxide修飾 用 peperidine切斷 DNA的磷酸雙酯鍵 切下修飾過(guò)的錯(cuò)配鹼基，依電泳片段的長(zhǎng)度大小判斷突變的情形 用於 1 kb或更長(zhǎng)的 DNA突變分析上，有極 高的檢出率 缺點(diǎn)：須放射性標(biāo)記及使用有毒的化學(xué)物質(zhì) 錯(cuò)配鹼基的酶學(xué)切斷法 Enzyme cleavage of mismatch T4內(nèi)切酶 VII，會(huì)切除錯(cuò)配的雜合雙鏈 單一鹼基的錯(cuò)配及形成小圈環(huán) ( small loop )都會(huì)被切斷 可以使用於超過(guò) 1 kb長(zhǎng)度，但有時(shí)會(huì)有非特異性切 斷產(chǎn)物，使得結(jié)果很難分析 植物的內(nèi)切酶 CELI效果較好， 較少非特異性的背景產(chǎn)生 連接酶鏈鎖反應(yīng) ligase chain reaction, LCR 1991 Barany設(shè)計(jì)二個(gè)相鄰的特異性寡核苷酸，只有待測(cè)的序列與二個(gè)寡核苷酸互補(bǔ) 以連接酶將二個(gè)相鄰的寡核苷酸連接起來(lái)，而有產(chǎn)物產(chǎn)生 新的產(chǎn)物又可以在下回合加溫降溫反應(yīng)中當(dāng)成新的 模板，經(jīng)過(guò) 30回合後，產(chǎn)物跑電泳就可以分辨突變的有無(wú) RFLP (restriction fragment length polymophisms)或 PCRRFLP 人類(lèi)非編碼區(qū)大約 2022~4000 bp中會(huì)有一個(gè)變異點(diǎn)，編碼區(qū)大約 1000 bp左右會(huì)有一個(gè)變異點(diǎn) 這些變異是單鹼基（核苷酸）多形性 (SNP)的基礎(chǔ) 有時(shí)突變點(diǎn)會(huì)破壞或產(chǎn)生一個(gè)限制酶辨識(shí)位，這種變化可被 DNA blotting或 PCRRFLP檢測(cè)出來(lái) SNP (Single nucleotide polymorphism) 基因組中特定位點(diǎn)的單一鹼基多形性，非編碼區(qū)比編
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1