【正文】 的改變是相當(dāng)巨大的。細(xì)胞和基材的黏附很大程度上由吸附的血清蛋白層決定 ,血清中 200 種以上的蛋白質(zhì)經(jīng)過競(jìng)爭(zhēng)吸附過程后形成吸附層 ,其中有少量的蛋白質(zhì) (如纖連蛋白、層連蛋白及玻連蛋白等 )有助于細(xì)胞黏附 ,但是吸附層中不促進(jìn)細(xì)胞黏附作用的蛋白質(zhì) (如白蛋白 ) 卻占多數(shù) ,因此消除非特異性吸附非常重要。然而基質(zhì)表面性質(zhì)和細(xì)胞 響應(yīng)相關(guān)性遠(yuǎn)未闡明 ,尚不能進(jìn)行控制。 在各種特定的肽序列中，以精氨酸 － 甘氨酸 － 天冬氨酸 (RGD) 序列最為顯著 【 61】 。組織工程中將多肽固定在生物材料表面 ,制成受體專門性材料 ,可促進(jìn)受體介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)材料的黏附來提高其生物相容性 ,促進(jìn)細(xì)胞黏附、擴(kuò)展和細(xì)胞骨架的形成 ,實(shí)驗(yàn)證明 RGD 多肽修飾的材料能顯著增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的持續(xù)時(shí)間。 一般講 ,親水性表面對(duì)細(xì)胞黏附有促進(jìn)作用 ,疏水性表面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附功能較強(qiáng)。 研究表明 ,血清中的蛋白質(zhì)在材料表面的正電荷區(qū)和負(fù)電荷區(qū)的吸附行為差異很大 ,在正電荷區(qū)吸附的玻連蛋白對(duì)細(xì)胞的粘連具有積極影響 ,因此 ,材料表面正電荷區(qū)吸附玻連蛋白對(duì)骨樣細(xì)胞的黏附、鋪展及遷移至關(guān)重要。材 18 料表面如果具有可供反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán) ,可與配基共價(jià)連接 ,固定一些生物活性分子在材料表面 ,如細(xì)胞黏附因子等 ,從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附。吸附不牢固、易脫落 ,是其一大缺點(diǎn)。與其它方法相比 ,截留法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) ,它幾乎在所有化學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行 ,工藝簡(jiǎn)單 ,效果頗佳。對(duì)于生物活性分子的化學(xué)鍵合 ,研究者們更注重于材料的表面設(shè)計(jì) ,即根據(jù)生物活性物質(zhì)特點(diǎn)設(shè)計(jì)可與其反應(yīng)的表面基團(tuán)。 Klee 等將單體 4－ 氨基二聚對(duì)二甲苯鄰甲酸 650 ℃減壓條件下化學(xué)蒸氣沉積 ,18 ℃下濃縮在聚偏二氟乙烯 (PVDF) 表面 ,環(huán)己二 異氰酸酯 (HDI) 活化表面氨基 ,接枝上纖連蛋白 (FN) ,培養(yǎng)成骨細(xì)胞 ,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力大大提高。 Kwon 等采用預(yù)輻射接枝技術(shù) ,將甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯 (EPMA) 接枝到聚丙烯 (PP) 表面 ,引入磷酸官能團(tuán)并且在表面固定肝磷脂 ,實(shí)驗(yàn)表明黏附血小板數(shù)量減少 ,血栓形成降低 ,提高了材料的血液相容性。 通過光化學(xué)固定法可將疊氮基苯衍生物固定在聚合物表面 , 對(duì)材料進(jìn)行表面修飾。 等離子體表面接枝共聚改性是通過四步基元反應(yīng)實(shí)現(xiàn) : (1) 等離子體的產(chǎn)生與維持 。 由于等離子體改性具有改性層被嚴(yán)格限制在材料表面 (通常為幾個(gè) nm) ,對(duì)材料本體物理性能影響極 小 ,改性條件容易改變和控制等優(yōu)點(diǎn)而受到人們青睞。體外培養(yǎng)L929 成纖維細(xì)胞 ,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力不錯(cuò)并且改性基質(zhì)膜可以控制細(xì)胞的形態(tài)。用過硫酸鹽氧化 PP 中空纖維 ,可在其表面引入羥基 。 聚合物表面修飾固定生物活性分子快速、簡(jiǎn)單 ,在一定程度上可以有效改善聚合物對(duì)細(xì)胞的黏附性能。一些物質(zhì) , 如白蛋白 ,本身沒有粘附活性 , 但容易吸附在材料表面 , 而多肽又容易和白蛋白共價(jià)結(jié)合 。除去 PLLGRGDS的 Boc末端基團(tuán)及側(cè)鏈上的保護(hù)性基團(tuán)。而非簇狀固定的 YGRGD肽即使在最高的表面配體濃度時(shí) , 也幾乎不支持 NR6成纖維細(xì)胞的移動(dòng)。姚康德等以糖胺聚糖 (GAGs)結(jié)構(gòu)類似物殼聚糖及其衍生物修飾聚乳酸膜 ,并以鼠顱骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。郭曉 東等設(shè)計(jì)了一種含 RGD 多肽，可以作為非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，將其固定在此三嵌段材料表面，可以成功地將對(duì)骨組織工程至關(guān)重要的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 1基因轉(zhuǎn)染于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，體現(xiàn)了“基因活化基質(zhì)材料”的理念 【 85－ 87】 。為克服蛋白在生物材料表面的非選擇性吸附 ,促進(jìn)細(xì)胞的特異性黏附 ,J 等采用一端為氨基的聚乙二醇 (H2NPEGOH) 引發(fā) LA 開環(huán)共聚得到 H2NPEGPLA二嵌段共聚物 ,利用聚合物末端氨基分別鍵合琥珀酰亞胺酒石酰胺、琥珀酰亞胺琥珀酰胺、馬來酰亞胺丙酰胺 ,合成出三種端基含活性基團(tuán)的聚合物。聚反丁烯二酸丙二醇酯 (PPF) 是一種含有很多不飽和雙鍵的鏈狀聚酯 ,由于其交聯(lián)聚合物的水解產(chǎn)物是人體自然存在的物質(zhì) ,成為目前水凝膠研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在人角膜上皮細(xì)胞基底膜表面也觀察到類似的特征結(jié)構(gòu)。 同時(shí)對(duì)表層微觀形貌結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的極化和定向生長(zhǎng)的影響研究發(fā)現(xiàn) ， 表面規(guī)則凹槽形的深度和寬度都對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響 。 細(xì)胞在識(shí)別材料表面特征時(shí) ,可響應(yīng)微米和納米尺度的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) ,產(chǎn)生接觸引導(dǎo) ,所以人們可利用材料表面拓 撲結(jié)構(gòu)來調(diào)控細(xì)胞行為。m2的“小島”上白蛋白分泌速率最為穩(wěn)定。 對(duì)于表面具有孔洞型結(jié)構(gòu)的支架研究發(fā)現(xiàn) ， 當(dāng)孔徑較小時(shí) （ 如 2－ 5181。生物材料表面的微圖案化 ,有望促進(jìn)且調(diào)控特異細(xì)胞的生長(zhǎng)和空間分布。m2 的“小島”上肝細(xì)胞的白蛋白分泌速率最大 。 當(dāng)凹槽的寬度明顯大于細(xì)胞尺寸時(shí) ， 細(xì)胞的定向響應(yīng)不明顯 ； 而當(dāng)凹槽的寬度比細(xì)胞尺寸小或相當(dāng)時(shí) ， 細(xì)胞的定 26 向響應(yīng)就很明顯了 。 利用血細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)模式的超微評(píng)估方法 ， 發(fā)現(xiàn)與光滑表面相比 ， 上皮細(xì)胞和成纖細(xì)胞更易附著于微粗糙表面 (即表面的起伏在 10nm50181。 利用電子顯微鏡測(cè)量猴角膜上皮細(xì)胞基底膜表面的特征結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn) , 特征結(jié)構(gòu)的平均高度在 147～ 191nm 之間 , 平均纖維細(xì)絲的寬度約為 77nm。蛋白和多肽可以被水凝膠物理包覆 ,也可以與形成水凝膠的聚合物鍵合。結(jié)果顯示 ,固定 RGD 后的膜比未固定的 膜顯示出更好的細(xì)胞黏附性 ,而且共聚物中蘋果酸單元的成分越高 ,固定 RGD的數(shù)量越多 ,細(xì)胞黏附性越好。 鄭啟新教授等研究發(fā)現(xiàn)，和單純 PLGA 材料相比，三嵌段改性材料對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的黏附性明顯提高 【 84】 。在 Varma等及 Barrere 等的研究中 ,應(yīng)用仿生的方法 ,可分別在磷酸化的殼聚糖膜和鈦合金 Ti－ 6AL－ 4V 表面以磷酸鈣涂層修飾。 Maheshwari等 【 77】將 YGRGD 肽固定在無粘附活性的材料上 , 制成具有不同的表面配體濃度及不同的 23 簇狀空間分布特征 , 觀察 NR6 成纖維細(xì)胞的粘附、移動(dòng)情況 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) NR6 成纖維細(xì)胞的移動(dòng)速率依賴于配體空間分布。 Robin A等學(xué)者將 PLA 熔化 , 制成 PLA 膜。自組裝和模板技術(shù)將在下面予以介紹。共價(jià)鍵的形成一般包括材料表面的反應(yīng)部分和氨基酸側(cè)鏈或氨基、羥基末端。 8 聚合物表面的基團(tuán)轉(zhuǎn)化 利用聚合物材料中本身的基團(tuán)反應(yīng)或通過主鏈側(cè)基上某些反應(yīng)活性高的基團(tuán)或原子的反應(yīng) ,可使聚合物表面產(chǎn)生小分子功能基團(tuán)。 Wang 等用低溫等離子體技術(shù)與膠原涂覆 的方法對(duì)聚乳酸 (PDLLA)膜進(jìn)行了表面改性 ,有效改善了 PDLLA 與 3T3成纖維細(xì)胞間親和性 ,在膜上粘附細(xì)胞的數(shù)量及增長(zhǎng)速率均明顯提高。在等離子體環(huán)境下共聚 ,其體系溫度接近室溫 ,這有利于聚合反應(yīng)的正向進(jìn)程。 6 等離子體技術(shù) 等離子體沉積法修飾表面是一常規(guī)方法 ,可以在材料表面形成所需的功能團(tuán) ,改變表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) ,抑制材料表面非特異性作用。 (2) 反應(yīng)程度易控制。由于放射線能量比化學(xué)鍵能高 ,利用它照射材料表面后 ,聚合物表面經(jīng)離子化 ,激發(fā)產(chǎn)生自由基 ,自由基與單體接枝聚合 ,達(dá)到改性目的。偶合接枝是一種簡(jiǎn)單可行的方法 ,化學(xué)鍵共價(jià)固定生物分子通常以雙官 能團(tuán)交聯(lián)劑為中介 ,交聯(lián)劑的一端通過 — COOH、 — OH、 — NH2 等官能團(tuán)連接在基體材料表面 ,另一端有一可變的懸吊基團(tuán)用于結(jié)合單體分子。大量的研究集中在材料表面接枝親水性單體 ,以改善材料表面的親水性 ,提高其細(xì)胞親和力。然后用非溶劑相浸泡 ,使高聚物表面鏈段收縮 ,溶脹現(xiàn)象消失。 目前 ,高分子生物材料的表面修飾大致有如下幾條途徑 : 1 物理包被法 通過一個(gè)能連續(xù)循環(huán)浸漬的裝置 ,將溶液中的化學(xué)成分通過物理吸附力 (范德華力、靜電作用、親 / 疏水相互作用等 ) 的作用引入生物材料最外層表面。由于磺酸基能模擬肝素的生理活性而顯示出較好的促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的性質(zhì)。 Satriano 等采用 52keV 氬離子束照射聚羥基甲基硅氧烷和聚對(duì)苯二甲酸乙二酯 ,優(yōu)化了基體材料的表面自由能參數(shù) ,促進(jìn)了人真皮 成纖維細(xì)胞在改性材料上的黏附和增殖。而 Kieswetter 等運(yùn)用掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞在不同粗糙度生物材料表面的形態(tài)證實(shí) ,細(xì)胞在光滑、平整的材料表面較粗糙的材料表面上更容易伸展成連續(xù)的細(xì)胞層。 根據(jù)組織工程對(duì)生物材料的基本要求 ,需要抑制非特異性相 互作用而構(gòu)建特異性識(shí)別位點(diǎn) ,以誘發(fā)細(xì)胞和組織響應(yīng)。黏著斑由整連蛋白作為主要黏附受體和相關(guān)細(xì)胞質(zhì)斑蛋白包括踝 蛋白、紐蛋白、α － 肌動(dòng)蛋白、張力蛋白、樁蛋白和大量蛋白激酶組成。細(xì)胞首先要在支架表面黏附上 ,才能夠增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。 細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間粘連不僅使其保持形態(tài) ,還起著細(xì)胞間信息傳送和功能調(diào)節(jié)的重要作用。 綜上所述，納米組織工程材料制備技術(shù)是一門新興的技術(shù)，還有許多丞待解決的問題?；钚苑肿尤缟L(zhǎng)因子，藥物和基因可直接混入聚合體溶液。平滑肌細(xì)胞在納米纖維基質(zhì)中培養(yǎng) 7天后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞滲入基質(zhì)并整合于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。 Li 等 【 49－ 51】 在 PLGA 或 PCL 納米纖維上培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：納米纖維的結(jié)構(gòu)能夠支持細(xì)胞的黏附和增殖。柱形拉出及退火的納米纖維不僅能增強(qiáng)纖維的方向而且能增強(qiáng)晶體的方向。因此，在組織工程支架上控制細(xì)胞的方向是非常重要的。 在 電子紡絲 技術(shù)中，可以通過調(diào)節(jié)參數(shù)（聚合體濃度，聚合體溶液的流動(dòng)速率，溶劑的導(dǎo)電率，溫度等等）來控制納米纖維的直徑。通過控制孔隙結(jié)構(gòu)間纖維的直徑來控制支架的形狀，通過操作系統(tǒng)良好的控制，可一步一步獲得任意形狀的支架。 應(yīng)用相分離技術(shù)可制備出 相連管狀孔道結(jié)構(gòu)，并具有納米纖維孔壁結(jié)構(gòu)。某種蛋白對(duì)納米纖維支架的特殊親和力表示這種結(jié)構(gòu)可以作為一種選擇性的酶作用底物，增加 ECM與細(xì)胞間的相互作用。④將溶劑置換后的凝膠移至冰箱中冷凍一段時(shí)間 。 纖維直徑約 50－ 500nm，孔隙率大于 98％（ a: SEM 500， b: SEM 20K）。 溶液噴絲法可制備具有一定厚度和形狀的無紡布 , 有一定的力學(xué)性能 , 加工成型安全 而且容易操作 , 與溶液澆鑄－粒子浸出法制備的多孔支架相比 , 無紡布支架連通性好 , 有利于細(xì)胞的黏附以及營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的進(jìn)出。植入狗體內(nèi)易于內(nèi)膜化 ,沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)化和血栓。為克服上述缺點(diǎn) ,近來Chu等人將細(xì)胞包埋在用電子紡絲法制備的雙 層纖維膜中 ,形成纖維膜 / 細(xì)胞 / 纖維膜結(jié)構(gòu)。 最近 ,Jin等 【 30】 將人骨髓干細(xì)胞 (hBMSCs) 種植在由絲素和 PEO(聚氧乙烯 ) 共混后電子紡絲制備的纖維支架上。Ⅰ型膠原纖維的平均直徑 250nm，天然的聚合體，如：膠原，絲蛋白，彈力蛋白衍生肽，纖維蛋白原，酪蛋白及脂肪酶甚至 DNA都可以用 電子紡絲 技術(shù)處理，生成納米纖維。 Huang 等用基因工程的方法合成一 條含 多次 重復(fù) 的彈 力蛋 白多 肽鏈 ，（ ValProGlyValGly ）4(ValProGlyLysGly)。 1934 年 Formhals 首先申請(qǐng)了 電子紡絲 技術(shù)的專利。細(xì)胞的展開在 50％ molar 的（ IVHI） PA 雙分子層及（ C18） 2GluC2COOH3親水分子面明顯增加。 4 圖 111兩親性多肽（ PA） 圖 112兩親性多肽自組裝形成圓柱狀納米纖維 , 納米纖維直徑約為 。m（圖 11－ 2）。 為了模擬形成 天 然骨的納米結(jié)構(gòu) , Stupp等 【 16－ 19】 應(yīng)用 pH控制的自組裝技術(shù)設(shè)計(jì)合成了一種 兩親性多肽（ PA） , 可以自組裝生成納米結(jié)構(gòu)纖維支架 。在典型的結(jié)締組織中，結(jié)構(gòu)蛋白纖維，如膠原纖維和彈性蛋白纖維的直徑從幾十納米到幾百納米，這些納米級(jí)蛋白纖維相互交纏 ，形成非編織狀的網(wǎng)，為組織提供拉力和彈力。 納米纖維支架材料的制備 除可注射性材料以外 ,大多數(shù)組織工程支架必須預(yù)先制成多孔支架。納米組織工程學(xué)（ Nano tissue engineering）就是將納米科學(xué)與技術(shù)和組織工程學(xué)有機(jī)結(jié)合，從原子、分子水平認(rèn)識(shí)細(xì)胞和組織的基本結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)及活動(dòng)規(guī)律，并研制具有特定功能的仿生納米裝置和材料，為更好地恢復(fù)、維持或改善病損組織的功能奠定基礎(chǔ) 【 1－ 4】 。它的提出、建立和發(fā)展是對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織、器官缺損和功能障礙傳統(tǒng)治療方法和模式的一次革 命，孕育著巨大的科學(xué)價(jià)值和廣闊的臨床應(yīng)用前景，是 21 世紀(jì)生命科學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一，必將產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益 【 1－ 2】 。其它領(lǐng)域如骨、膀胱、血管、角膜、神經(jīng)、輸尿管、肝、胰、心臟瓣膜、血細(xì)胞、食管、腸管等的研究也正處于積極的實(shí)驗(yàn)階段。為最終解決目前組織工程學(xué)研究存在的 基本問題提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持 【 34】 。納米材料制備技術(shù)可以對(duì)基質(zhì)材料表面的納米結(jié)構(gòu) (nm)進(jìn)行設(shè)計(jì)和加工。因此，納米纖維支架較傳統(tǒng)的支架更有發(fā)展前途 【 13－ 15】 ，也是本章討論的重點(diǎn)。 (3) 含三個(gè)甘氨酸的交連部分，以提供親水性的頭基與堅(jiān)硬的交聯(lián)區(qū)域的結(jié)合 。在 pH=8時(shí)將二硫蘇糖醇注入 PAs，然后調(diào)整 pH=4，酸化的 PAs很快自組裝交聯(lián)固化而形成納米纖維。 PA 由 a1(IV)12631277 膠原序列 GlyValGlyAspLysAsnProGlyTrpProGlyAlaPro（