分子生物學(xué)葵花寶典-免費(fèi)閱讀
【正文】 （二十七）、基因治療的策略？答:基因置換或稱基因矯正:特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分子。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞具有不同的特性；注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。Taq DNA聚合酶 7580℃時(shí)具有最高的聚合酶活性，150個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95℃仍有活性。? 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。（十七）、PCR引物設(shè)計(jì)的基本要求？答:引物長(zhǎng)度一般為15～30個(gè)核苷酸。DNA模板變性:模板雙鏈DNAamp。隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？答:cDNA探針:通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴(kuò)增。溫度:溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度。2’,3’ddNTP與普通dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?’位置缺少一個(gè)羥基。（七）、cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？答:組成:胞外信息分子（主要是胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素），受體，G蛋白，AC，cAMP , PKA。（三）、分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、基因組的結(jié)構(gòu)與功能基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、調(diào)控及生物學(xué)效應(yīng)；生物大分子之間的相互作用這些相互作用構(gòu)成的細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、功能表達(dá)調(diào)控的分析基因的制備、改造、調(diào)控、應(yīng)用所需的各種技術(shù)體系。真核基因是斷裂基因。細(xì)菌基因組中存在有可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子?；蚪M中只有1個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。5cDNA文庫(kù) 將cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。4CAP:是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多操縱子，使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他碳源。它是生物在進(jìn)化過程中逐漸形成的精確而靈敏的生存和應(yīng)變能力。4管家基因:在生物體生命的全過程都是必須的，且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為RFLP。當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞無限制增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。2基因打靶:是指通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。轉(zhuǎn)染:指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。1分子克隆:在體外對(duì)DNA分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。在反式作用因子中，可直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，稱為轉(zhuǎn)錄因子。基因:能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，是決定遺傳性狀的功能單位。順式作用元件:是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的特異DNA序列。信息分子:調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。1轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程?？梢蕴岣逷CR的效率和特異性。3同義突變:堿基對(duì)的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止，有時(shí)雖然有堿基被取代，但在蛋白質(zhì)水平上沒有引起變化，氨基酸沒有被取代，這是因?yàn)橥蛔兒蟮拿艽a子和原來的密碼子代表同一個(gè)氨基酸的突變。它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒無復(fù)制作用，但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。4三鏈DNA:當(dāng)某一DNA或RNA寡核苷酸與DNA高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成三鏈，能特異地結(jié)合在DNA的大溝中，并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵。如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，這種基因是可阻遏基因。4核酸探針:探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用，并在相互作用之后可以檢測(cè)出來的生物大分子。5抑癌基因 是指存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類基因在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。過程包括：目的基因的獲取、基因載體的選擇與構(gòu)建、目的基因與載體的拼接、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選并無性繁殖含重組體分子的受體細(xì)胞以及陽性克隆的表達(dá)。非編碼區(qū)主要是一些調(diào)控序列。真核基因都由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。不同的核苷酸組成不同的核酸。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知序列。核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長(zhǎng)度。RNA探針:采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。（十六）、PCR的基本原理？答:PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。雜交鏈，引物的Tm值。G+C含量一般占45％ 55％。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物
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