【正文】 4. 發(fā)射激光，對胚胎透明帶周長的1/6至1/4進(jìn)行削薄。十、 輔助孵化輔助孵化是通過對于透明帶的操作，幫助囊胚從透明帶中孵化，以利于胚胎種植于子宮內(nèi)膜。4. 迅速將冷凍載桿尖細(xì)端浸入四孔板TS液中（37℃）靜置1分鐘。胚胎進(jìn)入VS到放入液氮的操作必須在60秒內(nèi)完成（因VS含有毒性，操作時間拖長可能會對胚胎產(chǎn)生不良影響）。按冷凍登記本上的編號在標(biāo)簽上標(biāo)記冷凍管編號、病人名字、冷凍日期，并將其貼在冷凍載桿柄上；在另一標(biāo)簽上寫下丈夫名字，貼于套管上。如果在D5未形成囊胚，換同樣的囊胚培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)胚胎1天，在D6評估能否用于移植或冷凍。（2） 實(shí)驗室胚胎移植者和核對者必須雙人核對，認(rèn)真檢查胚胎、培養(yǎng)皿的標(biāo)記、記錄情況和移植患者的一致性。（4） 卵裂球數(shù)和質(zhì)量相同的胚胎中，選擇透明帶薄、色澤正常的胚胎進(jìn)行移植。在使用的當(dāng)天早上，準(zhǔn)備當(dāng)天移植用的皿（Falcon 3037），將移植皿寫上患者的姓名，皿中內(nèi)孔加500ml已平衡好的G1 Plus或G2 Plus培養(yǎng)液，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡30分鐘后才能移入胚胎。（六） 注意事項1. 觀察過程應(yīng)迅速，盡量減少胚胎在培養(yǎng)箱外暴露的時間。IV級：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象；碎片在50％以上。根據(jù)兩原核的大小、形態(tài)、核仁數(shù)目、大小和分布等，分為Z1Z4級。GV期卵子：外觀顏色清淡，細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)尚未消失，在此階段的卵子胞漿中可看見細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。Ⅲ級：這級卵子通常為成熟卵。（3） 盡量減少PVP注射入卵子中。將注射針在精子尾部中段或下段輕壓，迅速回拉注射針，劃過精子，使其制動。9. 安裝、調(diào)節(jié)顯微注射系統(tǒng)：打開顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)及載物臺熱臺，確保所有操作控制都恢復(fù)至原有的可控操作內(nèi)，可以平穩(wěn)、舒適地進(jìn)行操作。5. 脫顆粒針的拉制：取1根巴斯德吸管，保持原口徑，煅燒鈍化端口。四、 卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）1. ICSI實(shí)驗室指征 嚴(yán)重的少、弱、畸形精子癥（1） 重度少精子癥：1106/ml≤射出的精液中精子密度≤5106/ml；（2） 重度弱精子癥：1%≤前向運(yùn)動精子（PR）≤10%；（3） 重度畸形精子癥：1%≤正常形態(tài)精子＜2%；（4） 極度少精子癥：精子密度＜1106/ml；（5） 極度弱精子癥：前向運(yùn)動精子（PR）＜1%；（6） 極度畸形精子癥：正常形態(tài)精子＜1%。2. 提前30分鐘打開恒溫操作臺預(yù)熱，將圓底加熱試管架放置于臺面同時加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。4. 根據(jù)受精前的精子活力和精子形態(tài)決定是否增加或減少所加精子的量。5. 取出平衡好的洗卵液加入已預(yù)溫的小培養(yǎng)皿中（Falcon 3001）；更換巴氏吸管，將撿卵皿中的卵子轉(zhuǎn)入洗卵皿中洗滌2次，再轉(zhuǎn)移至受精皿中，每孔不超過3枚卵子，立即將受精皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6. 如為ICSI授精方式，準(zhǔn)備卵裂液培養(yǎng)皿：用G1 Plus做成10個微滴，每滴25ml，每個患者準(zhǔn)備數(shù)目參照四孔板數(shù)，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡。7. 將有精子標(biāo)本的Falcon3001皿置室溫培養(yǎng)箱孵育2h。2. 術(shù)前，為臨床醫(yī)生準(zhǔn)備2個加3ml GIVF Plus 的Falcon3001皿，2個1ml的注射器。3. 把巴斯德吸管在酒精燈上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用，并連同15ml錐形離心管、5ml圓底試管一起標(biāo)上患者的姓名。5. 用手淫的方法往精液杯子內(nèi)射精。（六）逆行射精病人的尿液處理操作常規(guī)1. 一些患者在射精過程中精子會逆行到膀胱里，從而導(dǎo)致了無精子癥或者沒有明顯射精現(xiàn)象。（5） 將冷凍支架放置在距離液氮面15cm的液氮蒸氣中，保持10~20分鐘。（8） 再次棄去上層液體。（4） 去上層液體，加入適量GIVF Plus重懸沉淀，顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。（2） 去上清，打散混勻。（2） %密度梯度離心液于45%密度梯度離心液底部，保持兩種液體的界面。（2） 如有紅細(xì)胞，精液可呈現(xiàn)紅褐色，病人如有黃疸或服用某些維生素，精液可呈現(xiàn)黃色。（2） 給患者以明確的書面或口頭形式的有關(guān)精液樣本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)指導(dǎo)說明，應(yīng)強(qiáng)調(diào)采集樣本必須完整，（3） 將已標(biāo)記患者姓名和病歷號的容器交給患者，應(yīng)在采集后1小時內(nèi)送到實(shí)驗室。5. 獨(dú)立工作：在本中心上級技師督導(dǎo)下完成新人培訓(xùn)計劃，上級技師考核達(dá)標(biāo)，方可獨(dú)立工作。6. 冰箱：每日監(jiān)測，一旦出現(xiàn)故障，立即報修，并立即轉(zhuǎn)移冰箱內(nèi)物品。(二) 設(shè)備緊急故障1. CO2培養(yǎng)箱：至少三臺備用，每日監(jiān)測，一旦出現(xiàn)故障，立即報修，并暫時以正常運(yùn)行的培養(yǎng)箱替代故障培養(yǎng)箱。(十三) 實(shí)驗室組織管理和質(zhì)量監(jiān)督1. 實(shí)驗室工作人員除進(jìn)行配子的處理和培養(yǎng)外，還要進(jìn)行一系列的常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測，意外事件的詳細(xì)記錄和相應(yīng)對策的結(jié)果評估。將實(shí)驗管和對照管置于室溫，每24小時用Makler計數(shù)板計數(shù)實(shí)驗管及對照管內(nèi)的活動精子比率，并計算48小時的生存指數(shù)。2. 耗材管理（1） 耗材到貨時需立即清點(diǎn)、核對，記錄到貨時間、名稱、編號、批號、數(shù)量、收貨人等。5. 定期由專業(yè)技術(shù)人員對儀器、設(shè)備進(jìn)行校驗，建立設(shè)備使用檔案。1. 冷藏層：2~8℃；2. 冷凍層：15~20℃。2℃之間，濕度在40%以上，每日觀察并記錄溫度和濕度，如果波動過大及時進(jìn)行調(diào)整，若有異常，盡快維護(hù)和處理。(四) 液氮罐的質(zhì)量控制1. 胚胎冷凍液氮罐需每天查看外觀，每周至少兩次檢測剩余量，按時添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。消毒清潔完成后，需開機(jī)運(yùn)行穩(wěn)定后方可使用。二、 實(shí)驗室質(zhì)量控制(一) 培養(yǎng)箱的質(zhì)量控制專人管理，每日確認(rèn)以下各項內(nèi)容并予以記錄：1. CO2的控制：6%177。7. 被體液沾染時，必須馬上用消毒液或肥皂清洗。為避免停電影響設(shè)備正常運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)備有雙重供電系統(tǒng)，或不間斷電源（UPS），以確保二氧化碳培養(yǎng)箱和顯微鏡等關(guān)鍵設(shè)備在意外停電時滿足正常工作。5. 當(dāng)接觸體液或盛放體液的容器時，應(yīng)帶一次性無粉橡膠或塑料手套。例如離心時必須用帶蓋的試管。5. 消毒清潔：每隔3個月消毒培養(yǎng)箱。CODA過濾器應(yīng)定期更換，根據(jù)供氣量，每36個月更換一次。2. 超凈工作臺應(yīng)于每天工作前提前30分鐘開啟，臺面溫度應(yīng)穩(wěn)定于設(shè)定的溫度。如果壓差＜5Pa，應(yīng)查找原因，及時檢修和維護(hù)。2. 保存各種設(shè)備的使用說明文件。（3） 使用前準(zhǔn)備：培養(yǎng)液使用前必須過夜平衡。（5） 不同批號的耗材需要通過精子存活試驗后方可使用。(十二) 實(shí)驗室數(shù)據(jù)指標(biāo)的定期回顧總結(jié)每月統(tǒng)計實(shí)驗室的各種數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析和檢查。(十四) 中心常用試劑、耗材一覽表本生殖醫(yī)學(xué)科目前鼠胚實(shí)驗常規(guī)使用Vitrolife G5系列培養(yǎng)基。對現(xiàn)用液氮罐進(jìn)行定期檢測，一旦發(fā)現(xiàn)異常泄漏，立即轉(zhuǎn)移故障罐內(nèi)的胚胎或精子。3. 理論學(xué)習(xí)：衛(wèi)生部【176】號文件，人類輔助生殖倫理原則，實(shí)驗室質(zhì)控，基礎(chǔ)內(nèi)分泌、遺傳學(xué)理論，人類卵子、精子發(fā)生生理，精子獲能，IVF、ICSI適應(yīng)癥，卵子形態(tài)與成熟度，胚胎序貫培養(yǎng)系統(tǒng)，精子、胚胎凍融原理，ICSI安全性等。（5） 待精斑晾干后編號保存兩年，在精液處理記錄本上記錄患者信息，編號和保存位置。（3） 報告中應(yīng)注明樣本的采集是在利用避孕套通過性交法獲取的及采集地點(diǎn)（4） 一定不可以使用普通避孕套收集精液，應(yīng)為它一般含有干擾精子活力的成分（Jones 等，1986）(二) 精液標(biāo)本分析1. 精液液化（1） 精液取出后室溫液化15分鐘到30分鐘，用吸管或者在顯微鏡中觀察檢查精液是否完全液化，在家中或利用避孕套采集的樣本通常在送達(dá)實(shí)驗室時已液化。巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓鈍，冷卻后待用；15ml 錐形離心管（配置梯度離心液）和5ml的圓底試管（上游法）上標(biāo)上患者夫婦的姓名。（7） 加入適量GIVF Plus重懸沉淀，計數(shù)精子濃度、活力等情況，并記錄。（2） 加入已液化好的精液，如果精液體積較多而精子數(shù)較少時再多加一管梯度離心液分離精子。（5） 棄去上層液體。（2） 待精液充分液化后，按照WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH值、液化情況、精子密度、活動率、精子動力以及細(xì)胞等情況，并認(rèn)真做好實(shí)驗室記錄。（3） 將標(biāo)本管打開，取10ml樣本涂片，生物顯微鏡觀察并記錄。其作用使尿液呈堿性，精子更易存活。(四) PESA精子處理操作常規(guī)1. 每一患者準(zhǔn)備洗精培養(yǎng)基 GIVF Plus兩管，每管3ml，提前一天配制好，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。8. 精子數(shù)目少的附睪穿刺液可以用直接離心洗滌法進(jìn)行處理，處理好的精子在鏡下觀察并記錄，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。6. 臨床醫(yī)生從睪丸中抽吸出曲細(xì)精管放于盛有GIVF Plus的Falcon3001皿中，送實(shí)驗室。3. 撿卵皿的準(zhǔn)備：吸取GMOPS Plus3ml培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿（Falcon 3001）內(nèi)蓋礦物油2ml，每個患者準(zhǔn)備2個，放在不通CO2氣體、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡。典型的OCCC用肉眼可看到，為灰色透亮的粘液團(tuán)，中央見到的小的白點(diǎn)為卵母細(xì)胞和放射冠，通常直徑在24mm大小。三、 體外授精操作常規(guī)（一） 體外授精1. 授精前