國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)豬牛羊體細(xì)胞克隆技術(shù)規(guī)范-免費(fèi)閱讀
【正文】 豬牛羊體細(xì)胞克隆技術(shù)規(guī)范為首次制定和頒布，建議列為推薦性標(biāo)準(zhǔn)較為適宜，今后根據(jù)實(shí)際需要，進(jìn)行不斷的修訂和完善。郭旭東博士在做羊的胚胎融合時(shí)[]選擇了種融合參數(shù)進(jìn)行比較：：在電極之間通以單個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長(zhǎng) μ；脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長(zhǎng) μ、脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長(zhǎng) μ、脈沖間隔 。電激活聯(lián)合輔助激活。圖 不同電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖次數(shù)對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。成熟卵母細(xì)胞中高水平的成熟促進(jìn)因子（）和細(xì)胞靜止因子（）使得卵母細(xì)胞停滯于Ⅱ期，而胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高能夠引發(fā)一系列的磷酸化和去磷酸化事件，最終導(dǎo)致活性降低而使得卵母細(xì)胞從Ⅱ期釋放出來(lái)。表 供體細(xì)胞饑餓對(duì)綿羊克隆胚胎的早期發(fā)育的影響供體細(xì)胞血清饑餓卵母細(xì)胞數(shù)克隆胚胎的體外發(fā)育數(shù)（）注射融合（）細(xì)胞細(xì)胞桑葚胚囊胚是（）（（）（）（）是（）（）（）（）（）是（）（）（）()()是()()()()()否（）（）（）（）（）新西蘭農(nóng)科院. 通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，使用血清饑餓誘導(dǎo)進(jìn)入期的體細(xì)胞經(jīng)過(guò)核移植后獲得的?？寺∨咛ピ谝浦埠蟮膽言新屎彤a(chǎn)犢率都明顯提升（圖）[]。在豬、牛、羊三種動(dòng)物的體細(xì)胞克隆中，胎兒成纖維細(xì)胞具有分離和體外培養(yǎng)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行體外基因改造且克隆效率較高的優(yōu)點(diǎn)，因此在體細(xì)胞克隆中被廣泛使用。由于根據(jù)王雪紅等的觀察，在不同時(shí)間段取樣觀察卵母細(xì)胞核相，得出了羊卵成熟、并停滯于Ⅱ期的時(shí)間段為體外培養(yǎng)后 ～ 。等[]研究了不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn) ～ 培養(yǎng)與 ～ 培養(yǎng)成熟率差異顯著（ ），但是通過(guò)染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，染色體異常率會(huì)有所增加。因?yàn)槁雅菀菏锹涯讣?xì)胞發(fā)育的微環(huán)境，主要提高卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟度；激素參與卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞核成熟和卵丘的擴(kuò)散，利于排出第一極體；生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞卵丘膨脹和促進(jìn)核成熟，能促進(jìn)成熟過(guò)程中某些蛋白質(zhì)的合成，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，受精后發(fā)育能力更強(qiáng)；含巰基物質(zhì)對(duì)于豬卵胞質(zhì)成熟有促進(jìn)作用，添加后可以顯著提高卵母細(xì)胞發(fā)育后期的卵裂率，這些已作為必須的添加成分。常規(guī)的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方法是使用空氣中的氧濃度進(jìn)行體外培養(yǎng)，但是空氣中氧的含量大約為 ，而通過(guò)對(duì)幾種哺乳動(dòng)物的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)輸卵管和子宮內(nèi)的氧含量大約為[]。177。）（表），且差異極顯著(＜)；將成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活后，優(yōu)級(jí)卵的囊胚率高于次級(jí)卵 （177。表 卵丘細(xì)胞對(duì)孤雌胚胎發(fā)育潛能的影響[]項(xiàng)目卵母細(xì)胞數(shù)（個(gè)）卵裂數(shù)（卵裂率）囊胚數(shù)（囊胚率）總細(xì)胞數(shù)優(yōu)級(jí)卵（177。在體內(nèi)狀態(tài)下，卵母細(xì)胞后續(xù)發(fā)育能力是在卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸獲得的，而卵丘細(xì)胞是卵泡中最重要的體細(xì)胞，其通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞之間保持密切的聯(lián)系，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)、能量和調(diào)節(jié)信號(hào)等，保證卵母細(xì)胞的成熟。指退化或死亡的卵母細(xì)胞。研究表明直徑過(guò)小的卵泡發(fā)育不完全，其中的卵母細(xì)胞不具有體外成熟的能力，而直徑過(guò)大的卵泡中的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)后可能老化。同時(shí)有研究表明用體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆其重構(gòu)胚胎的囊胚率和出生率均高于用體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞，但鑒于采集體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞操作復(fù)雜且經(jīng)濟(jì)成本較高，難以大規(guī)模生產(chǎn)，因此本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞克隆。在年，我國(guó)科學(xué)家賴良學(xué)發(fā)現(xiàn)敲除豬的也能大幅提高克隆豬的出生效率（圖），這表明通過(guò)敲除來(lái)提高克隆效率的策略在大動(dòng)物上可行的[]。主要體現(xiàn)在克隆胚胎囊胚質(zhì)量差，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)少或者沒(méi)有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，植入后妊娠率低，妊娠中流產(chǎn)率高，出生率低，圍產(chǎn)期死亡率高。非洲疣豬通常會(huì)攜帶非洲豬瘟病毒，卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，在很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)發(fā)病倒下。尤其是體細(xì)胞克隆技術(shù)與基因編輯技術(shù)的結(jié)合將為最終解決世界人口、糧食、環(huán)境、健康等影響世紀(jì)人類生存的重大問(wèn)題發(fā)揮不可估量的作用，為人類帶來(lái)不可估量的利益。經(jīng)過(guò)二十多年的不斷發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)先后成功獲得體細(xì)胞克隆綿羊、小鼠、牛、豬、山羊、貓、兔、馬、騾子、狗、雪貂、駱駝、水牛和狼等動(dòng)物。 主要工作過(guò)程(一) 組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，年月，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，并分配工作任務(wù)和安排工作進(jìn)度，會(huì)議研究討論并確定了標(biāo)準(zhǔn)編制的原則和指導(dǎo)思想；制定了編制大綱和工作計(jì)劃。(二) 標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)遵循《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》的有關(guān)要求。盡管如此，體細(xì)胞克隆技術(shù)仍然存在技術(shù)體系不統(tǒng)一、操作流程多樣以及缺乏可量化的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。另外在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育研究中，體細(xì)胞克隆技術(shù)也發(fā)揮著不可替代的作用。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于年完成。在細(xì)胞重編程方面，體細(xì)胞克隆技術(shù)是唯一的能夠獲得完整個(gè)體的細(xì)胞重編程技術(shù)。更進(jìn)一步地還可以建立各種基因模型，把握如癌癥等疾病產(chǎn)生的根本原因，為根治這些疾病提供技術(shù)條件。本標(biāo)準(zhǔn)的目的是建立豬、牛、羊三種重要家畜動(dòng)物的體細(xì)胞核移植技術(shù)規(guī)范，對(duì)體細(xì)胞克隆技術(shù)中的一般要求、卵母細(xì)胞采集、成熟培養(yǎng)、胎兒成纖維細(xì)胞分離、卵母細(xì)胞去核移核、重構(gòu)胚的融合與激活等技術(shù)操作進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。(四) 清洗與消毒同樣，在體細(xì)胞克隆中設(shè)計(jì)胚胎和體細(xì)胞的采集、分離培養(yǎng)等操作，對(duì)培養(yǎng)皿有較高要求，因此本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了清洗和消毒的要求。針對(duì)專家返回意見(jiàn)中的共性問(wèn)題，我們又組織了中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社、河北省畜牧局等單位的位專家討論了修改意見(jiàn)中的共性問(wèn)題，并制定了相應(yīng)的修改方案。與此同時(shí)，體細(xì)胞克隆過(guò)程中細(xì)胞重編程機(jī)制的相關(guān)研究也進(jìn)展迅速，不斷發(fā)現(xiàn)提高體細(xì)胞克隆效率的方法。美國(guó)密蘇里大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用基因組編輯技術(shù)獲得了 基因敲除豬。年，西北農(nóng)林科技大學(xué)陳玉林團(tuán)隊(duì)通過(guò)系統(tǒng)創(chuàng)制了基因編輯羊群體，對(duì)其中只陽(yáng)性羊和只野生型羊從出生至 的體重檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性山羊、綿羊的體重均顯著高于野生型羊，且陽(yáng)性羊的肌纖維直徑更寬、肌纖維橫截
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