【正文】 豬牛羊體細胞克隆技術規(guī)范為首次制定和頒布，建議列為推薦性標準較為適宜，今后根據(jù)實際需要，進行不斷的修訂和完善。郭旭東博士在做羊的胚胎融合時[]選擇了種融合參數(shù)進行比較：：在電極之間通以單個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ；脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ、脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ、脈沖間隔 。電激活聯(lián)合輔助激活。圖 不同電場強度和脈沖次數(shù)對豬體細胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。成熟卵母細胞中高水平的成熟促進因子（）和細胞靜止因子（）使得卵母細胞停滯于Ⅱ期，而胞質內鈣離子濃度的升高能夠引發(fā)一系列的磷酸化和去磷酸化事件，最終導致活性降低而使得卵母細胞從Ⅱ期釋放出來。表 供體細胞饑餓對綿羊克隆胚胎的早期發(fā)育的影響供體細胞血清饑餓卵母細胞數(shù)克隆胚胎的體外發(fā)育數(shù)（）注射融合（）細胞細胞桑葚胚囊胚是（）（（）（）（）是（）（）（）（）（）是（）（）（）()()是()()()()()否（）（）（）（）（）新西蘭農科院. 通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，使用血清饑餓誘導進入期的體細胞經過核移植后獲得的?？寺∨咛ピ谝浦埠蟮膽言新屎彤a犢率都明顯提升（圖）[]。在豬、牛、羊三種動物的體細胞克隆中，胎兒成纖維細胞具有分離和體外培養(yǎng)簡單，易于進行體外基因改造且克隆效率較高的優(yōu)點，因此在體細胞克隆中被廣泛使用。由于根據(jù)王雪紅等的觀察，在不同時間段取樣觀察卵母細胞核相，得出了羊卵成熟、并停滯于Ⅱ期的時間段為體外培養(yǎng)后 ～ 。等[]研究了不同培養(yǎng)時間對豬卵母細胞體外成熟的影響，發(fā)現(xiàn) ～ 培養(yǎng)與 ～ 培養(yǎng)成熟率差異顯著（ ），但是通過染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，染色體異常率會有所增加。因為卵泡液是卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，主要提高卵母細胞質的成熟度；激素參與卵泡發(fā)育，誘導豬卵母細胞核成熟和卵丘的擴散，利于排出第一極體；生長因子可誘導豬卵母細胞卵丘膨脹和促進核成熟，能促進成熟過程中某些蛋白質的合成，提高卵母細胞質量，受精后發(fā)育能力更強；含巰基物質對于豬卵胞質成熟有促進作用，添加后可以顯著提高卵母細胞發(fā)育后期的卵裂率，這些已作為必須的添加成分。常規(guī)的卵母細胞體外培養(yǎng)方法是使用空氣中的氧濃度進行體外培養(yǎng)，但是空氣中氧的含量大約為 ，而通過對幾種哺乳動物的檢測，發(fā)現(xiàn)輸卵管和子宮內的氧含量大約為[]。177。）（表），且差異極顯著(＜)；將成熟的卵母細胞進行孤雌激活后，優(yōu)級卵的囊胚率高于次級卵 （177。表 卵丘細胞對孤雌胚胎發(fā)育潛能的影響[]項目卵母細胞數(shù)（個）卵裂數(shù)（卵裂率）囊胚數(shù)（囊胚率）總細胞數(shù)優(yōu)級卵（177。在體內狀態(tài)下，卵母細胞后續(xù)發(fā)育能力是在卵泡生長過程中逐漸獲得的，而卵丘細胞是卵泡中最重要的體細胞，其通過縫隙連接與卵母細胞之間保持密切的聯(lián)系，為卵母細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)、能量和調節(jié)信號等，保證卵母細胞的成熟。指退化或死亡的卵母細胞。研究表明直徑過小的卵泡發(fā)育不完全，其中的卵母細胞不具有體外成熟的能力，而直徑過大的卵泡中的卵母細胞體外培養(yǎng)后可能老化。同時有研究表明用體內成熟的卵母細胞進行體細胞克隆其重構胚胎的囊胚率和出生率均高于用體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞，但鑒于采集體內成熟的卵母細胞操作復雜且經濟成本較高，難以大規(guī)模生產，因此本標準推薦使用體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞進行體細胞克隆。在年，我國科學家賴良學發(fā)現(xiàn)敲除豬的也能大幅提高克隆豬的出生效率（圖），這表明通過敲除來提高克隆效率的策略在大動物上可行的[]。主要體現(xiàn)在克隆胚胎囊胚質量差，滋養(yǎng)層細胞數(shù)少或者沒有內細胞團，植入后妊娠率低，妊娠中流產率高，出生率低，圍產期死亡率高。非洲疣豬通常會攜帶非洲豬瘟病毒，卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，在很短的時間內就會發(fā)病倒下。尤其是體細胞克隆技術與基因編輯技術的結合將為最終解決世界人口、糧食、環(huán)境、健康等影響世紀人類生存的重大問題發(fā)揮不可估量的作用，為人類帶來不可估量的利益。經過二十多年的不斷發(fā)展，科學家們已經先后成功獲得體細胞克隆綿羊、小鼠、牛、豬、山羊、貓、兔、馬、騾子、狗、雪貂、駱駝、水牛和狼等動物。 主要工作過程(一) 組成標準起草小組標準制定任務下達后，年月，組成了標準起草工作組，明確了任務要求，并分配工作任務和安排工作進度，會議研究討論并確定了標準編制的原則和指導思想；制定了編制大綱和工作計劃。(二) 標準制訂主要依據(jù)、標準編寫遵循《標準化工作導則 第部分：標準的結構和編寫規(guī)則》的有關要求。盡管如此，體細胞克隆技術仍然存在技術體系不統(tǒng)一、操作流程多樣以及缺乏可量化的質量控制標準等問題。另外在哺乳動物胚胎發(fā)育研究中，體細胞克隆技術也發(fā)揮著不可替代的作用。本項任務由中國標準化研究院提出并歸口，定于年完成。在細胞重編程方面，體細胞克隆技術是唯一的能夠獲得完整個體的細胞重編程技術。更進一步地還可以建立各種基因模型，把握如癌癥等疾病產生的根本原因，為根治這些疾病提供技術條件。本標準的目的是建立豬、牛、羊三種重要家畜動物的體細胞核移植技術規(guī)范，對體細胞克隆技術中的一般要求、卵母細胞采集、成熟培養(yǎng)、胎兒成纖維細胞分離、卵母細胞去核移核、重構胚的融合與激活等技術操作進行標準化和規(guī)范化。(四) 清洗與消毒同樣，在體細胞克隆中設計胚胎和體細胞的采集、分離培養(yǎng)等操作，對培養(yǎng)皿有較高要求，因此本標準規(guī)定了清洗和消毒的要求。針對專家返回意見中的共性問題，我們又組織了中國農業(yè)大學、農業(yè)農村部科技發(fā)展中心、中國農業(yè)出版社、河北省畜牧局等單位的位專家討論了修改意見中的共性問題，并制定了相應的修改方案。與此同時，體細胞克隆過程中細胞重編程機制的相關研究也進展迅速，不斷發(fā)現(xiàn)提高體細胞克隆效率的方法。美國密蘇里大學研究團隊利用基因組編輯技術獲得了 基因敲除豬。年，西北農林科技大學陳玉林團隊通過系統(tǒng)創(chuàng)制了基因編輯羊群體，對其中只陽性羊和只野生型羊從出生至 的體重檢測結果表明，陽性山羊、綿羊的體重均顯著高于野生型羊，且陽性羊的肌纖維直徑更寬、肌纖維橫截