真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核-預(yù)覽頁
【正文】 在微細(xì)胞中不能合成出 56?103dal、 42?103dal、 30?103dal、 28?103dal四種多肽。 2. 將含有外源基因的 λ 噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體基因組上的 外源片斷 進(jìn)行體外表達(dá)，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個(gè)小片段指導(dǎo)合成的。 （ IPTG） 2. 轉(zhuǎn)錄終止子 啟動(dòng)子封堵作用：由一個(gè)上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動(dòng)子時(shí)，便會(huì)使該啟動(dòng)子的功能受到抑制，將這種由一個(gè)啟動(dòng)子的功能活性抑制另一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動(dòng)子封堵作用。 5. 轉(zhuǎn)譯終止子 mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。 追蹤某種特定的 DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。 使用 galK（半乳糖激酶基因）作報(bào)告基因分離功能啟動(dòng)子 能夠檢測(cè)啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。 pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動(dòng)子的因素 1. 選用的報(bào)告基因 galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)（鑒定啟動(dòng)子表達(dá)活性的強(qiáng)弱）； 2. 應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動(dòng)子）。 1. 經(jīng)過 Hae? 切割的 203bp的酶切片斷上具有 Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、 CAP作用區(qū)以及 RNA聚合酶作用區(qū)、 β 半乳糖苷酶的頭 8個(gè)密碼子。 構(gòu)建： 1. 大腸桿菌染色體 DNA的 Hind? 片斷， 含有 trp啟動(dòng)子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。 λ 噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng) cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。 在 MS2聚合酶基因下游，存在 BamH?和 Hind ? 單切點(diǎn)。 組成： 1. pBR322的 Hae?－ EcoR片斷；編碼 ampr 2. λ 噬菌體的 Hae? Hae?片斷： λP L 3. pMK20質(zhì)粒的 Hae?片斷：編碼 kanr 4. 具有 ColE1復(fù)制起點(diǎn)的 Hae ?片斷： 經(jīng) pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分 優(yōu)點(diǎn)： 1. 形成包涵體 a. 蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離 b. 蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解作用 c. 蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害 2. 蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高 二硫鍵的斷裂 以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會(huì)導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)。 在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號(hào)肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。 （可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)） 優(yōu)點(diǎn)： 1. 蛋白質(zhì)的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化 3. 增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 4. 蛋白質(zhì) N末端的結(jié)構(gòu)真實(shí) 缺點(diǎn)： 1. 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的 2. 由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過程比較復(fù)雜 融合蛋白質(zhì)的表達(dá) 融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用 DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 融合蛋白質(zhì)的切割 將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。它們之間的距離 (17bp)。 響 富含大腸桿菌罕用密碼子的外源真核基因，很難在大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中得到有效
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