【正文】 個 DNA 分子連接在一起。載體的設計和應用是基因工程中的一個重要環(huán)節(jié)。應使重組質粒能增殖到一定的拷貝數(shù) (一般為 20～ 200 個 )，如在適當條件下所需時間大概為 20～ 30min，在 12h 內有可能增殖到 1010個。同時細胞中的基因含量較多而且大多數(shù)基因是氮拷貝的，因此必須采用有效的分離基因的技術和方法。 Mullis 博士也因此榮獲了 1993 年度諾貝樂化學獎。 PCR 技術實際上是在模板 DNA，引物和 4 種脫氧核苷酸存在條件下依賴于 DNA 聚合酶的酶促合成反應。而模板 DNA 雙鏈之間互補的機會較少；③延伸（ extension） 。每循環(huán)一次，目的 DNA 的拷貝數(shù)加倍，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，目的 DNA 以２ n2n 的量堆積。如下圖： 在一個有 cDNA 模板與特定結合位點的 DNA 引物、含有 4 種脫氧核苷酸混合物的緩沖液中，在 DNA 聚合酶 Taq 的催化下不斷合成 DNA，引物必須設計成能與 cDNA 的一個末端結合，而另一個引物能與互補鏈的另一個末端結合，當引物與目標片段退火后兩個鏈都能在 DNA 聚合酶的作用下得到復制。這一技術已取得很大的成功，并使有關基因家族的研究迅速增多。重組 DNA 分子的構型對后續(xù)的轉化過程有顯著的影響，例如用λ噬菌體載體構建的重組子在線性結構時，更適用于包裝成成熟的病毒顆粒而有效地轉染細胞，而質粒載體則應形成環(huán)狀結構才有利于轉化細菌。 將外源重組體分子導入受體細胞的途徑，包括轉化（或轉染）轉導、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。 四、克隆基因的表達 基因表達是基因工程中的主要內容，包括目的基因的轉錄、翻譯以及蛋白質產(chǎn)物的加工等內容。在克隆載體中通常僅帶有一個松弛型復制子、一個多克隆位點和一個篩選標記，以便被克隆和篩選的DNA 序列能夠大量增殖。原核表達系統(tǒng)主要有：大腸桿菌系統(tǒng)和枯草桿菌系統(tǒng)等。這些細菌沒有真核生物所具有的翻譯后的修飾作用，因此該系統(tǒng)特別適用于沒有修飾或只有有限修飾的蛋白質的合成。 為得到高水平表達，人們致力于研究在表達載體中插入適當片段的方法。食品生產(chǎn)中一直采用酵母為工具，這為將其應用于蛋白質藥物的生產(chǎn)提供了方便。 像大腸桿菌一樣， 也含有自然質粒 (2μ m 質粒 )，連上選擇性標記后可作為載體。酵母產(chǎn)生的糖蛋白對人有免疫源性，因而糖蛋白不適合在酵母中生產(chǎn)。目前，檢測基因表達的方法以及分析被檢測基因在細胞中轉錄和翻譯的情況有下列方法； Northern 雜交 檢測細胞中是否含有特定的 mRNA，測定特定 mRNA 在總 RNA 中的比例，由此獲得目的 mRNA 的轉錄情況。 免疫學方法 利用特異性抗體與目的蛋白質進行反應，經(jīng)免疫沉淀、 ELISA 等免疫學方法，檢測表達蛋白質。放射性標記靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列幾個步驟：①靶蛋白的放射性標記；②裂解細胞，③特異性免疫復合物的形成； ④免疫復合物的收集及純化；⑤放射性標記蛋白質的免疫沉淀分析。總的來說，任何一個在生理過程中扮演重要角色的蛋白質都能作為藥物研究 的靶點。已發(fā)現(xiàn)在血型受體分布中具有明顯的組織特異性，血型特異性藥物將具有更 高的選擇性，而且比同時作用于幾個受體血型的藥物具有更小的副作用。這些篩選方案就是尋找能 口服或吸人給藥的類似物，一旦前導化合物被發(fā)現(xiàn)，通過設計循環(huán)就可以設計出最優(yōu)的化合物 二、轉基因動物 轉基因動物可用來生產(chǎn)活性蛋白質藥物，但是轉基因動物用作疾病模型比用作生產(chǎn)工具更具重要性。 最簡單的轉基因鼠模型是在失控的條件下表達外源蛋白，雖然可以在一部分或全部器官中，但是為了達到 某種目的必須限制其在某些器官中表達，因此，要使用組織特異性調控因子。在一定條件下，基因并不是插入基因 組中任何位置，而是通過基因重組替換其同源序列，因為這種情況發(fā)生很少，必須建立篩選此類細胞的方法?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這些小鼠的種系細胞具有斷裂基因，這些小鼠用作繁殖帶有斷裂基因的小鼠。 轉基因小鼠模型用作許多疾病的模型 ，包括單基因和多基因的疾病。多基因疾病的例子是癌癥和動脈 粥樣硬化。這些轉運工具的抑制因子就可以用于治療，如果抑制因子在體外實驗有效，就可以在人體實驗之前用轉基因模型進行研究。 表 1 品名 分類 適應證 上市時間 胰島素 激素 糖尿病 1982 生長激素 激素 生長缺陷 1985 IFNα 細胞因子 腫瘤 1986 IFNγ 細胞因子 腫瘤 1990 IL2 細胞因子 腫瘤 1989 GCSF 細胞因子 白細胞減少 1989 GMCSF 細胞因子 白細胞減少 1991 EPO 細胞因子 貧血 1989 纖維蛋白溶酶原活化因子 抗溶血素 血栓形成 1987 因子 VIII 膠原因子 血友病 1989 α1 抗胰蛋白酶 酶抑制劑 α1 抗胰蛋白酶缺陷 1992 DNA 酶 I 酶 / 1994 乙肝亞單位疫苗 疫苗 預防肝炎 1988 現(xiàn)在大約有 150 種新型蛋白質藥物用于臨床實驗，其中約 100 種是真正的全新藥物，在醫(yī)療上沒有先例。反義核酸分子是由小分子的 DNA 或 RNA 組成，它們能同目標 mRNA 互補，因為這種互補作用，反義核酸分子能結合到目標上并抑制其翻譯成蛋白質。它將有可能引起新的藥物開發(fā)浪潮，并且可能在很長一段時期后代替蛋白質和其他治療方法，這一點是無可置疑的，就像基因拼接這一科學發(fā)現(xiàn)在短期內即給藥物發(fā)展帶來深刻的影響一樣，在可以預見的將來這種影響仍不會減少。此后， 1965 年發(fā)現(xiàn)了白細胞干擾素，1969 年發(fā)現(xiàn)了致敏細胞干擾素。用高表達質粒在大腸桿菌中進行表達，得到每升菌液中含 億Ｕ 的IFNα，相當于從 100Ｌ人血中獲得的提取量，尤其誘人的是用多角病毒載體將IFN在家蠶中表達，每 ml 體液中可獲得２億Ｕ的產(chǎn)物。 干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質，雖然在基因的調取、構建、表達方面仍有許多的工作在進行中，但研究的熱點已經(jīng)轉移到了臨床應用及臨床前的動物實驗方面，并且在許多疾病的治療方面取得了進展。 抗腫瘤 通過與糖基化的淋巴細胞毒素嵌合， IFNγ可以提高小鼠對 HT1080 纖維肉瘤、 G361 惡性黑色素 ZR751 乳腺瘤等腫瘤的抗性。早在 1906 年， Caront 等發(fā)現(xiàn)兔失血后在外周血中產(chǎn)生一種可作用于造血系統(tǒng)以加速紅細胞生成的物質， 由此提出存在一種體液因子以反饋方式調節(jié)血細胞生成的觀點。 EPO 是一個強有力的造血生長因子，體外分析顯示在 具有劑量依賴效應。 1977 年， Miyake 等從重癥再障貧血病人的尿中提取得到了 EPO 的純品，由于起始來源的匱乏，很難得到大量純品以充分研究其生物學和分子學性質。 自 1985 年 rhEPO 問世以來，它作為一種替代因子和藥物應用于臨床成為現(xiàn)實。 EPO 在成年健康男子中靜脈給予，一次量為 3600U 時，就能見到網(wǎng)織紅細胞增加；如隔日以 1800U 劑量連用３次，亦見到造血促進效果，血紅蛋白增加，鐵蛋白減低，網(wǎng)織紅細胞上升。 結蒂組織性貧血 類風濕關節(jié)炎和紅斑狼瘡（ SLE）所致的貧血病因不清，一般難以治療，大劑量（ 300U/kg 以上）輸注重組 EPO 有明顯療效，且無不良反映。 難治性貧血 在我反應性貧血、再生障礙性貧血等難治性貧血病人體內，EPO 量并不減少，從理論上講，用外源 EPO 不能促進造血