【正文】 t cell):經(jīng)過物理、化學(xué)方法處理而易于獲取外源 DNA的細胞。發(fā)明人： Edwin Southern(英） ? Northern blottting(RNA印跡 )： 不同分子量的 RNA經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用特異探針檢出目的RNA所在位置的方法。 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ polymerase chain reaction， PCR)：體外利用 DNA快速擴增特定基因或 DNA序列的方法。 ? TDNA（ transfer DNA):位于 Ti質(zhì)粒上的一段 DNA序列，該 DNA進入植物細胞后，可整合到植物基因組 DNA中 ,插入是隨機的。 ? 基因圖位克隆法（ mapbased cloning） :根據(jù)基因連鎖圖，確定決定某種表現(xiàn)型基因的方法。 ? 染色體步移（ chromsome walking):長鏈 DNA用核酸內(nèi)切酶進行部分切割，獲得系列片段，克隆進載體，由于片段之間存在重疊，可用一個片段作為探針，檢出其它片段，經(jīng)過測序后，可以把這些片段拼湊成一個連續(xù)的序列。熒光素標(biāo)記的核酸探針通過原位雜交，只和具有高度相似性的核酸雜交，可用于染色體上基因的定位。 ? 蛋白質(zhì)組學(xué)（ Proteomics): 研究某一物種、個體、器官、組織或細胞在特定條件、特定時間所表達的全部蛋白質(zhì)圖譜，以研究特定基因表達情況的科學(xué)。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 ? 組成型表達 （ constitutive expression）：組成細胞的基因有些能夠連續(xù)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。 ? 基因家族（ gene family ） :真核細胞中許多功能相關(guān)的基因成套組合，組成一個基因家族。 ? 順式作用元件（ cisacting element）： 真核生物的啟動子、增強子等是由若干 DNA序列構(gòu)成，它們常與特定的功能基因連鎖在一起，對基因轉(zhuǎn)錄具有重要調(diào)控作用，從而影響基因表達，這樣的 DNA序列稱為順式作用元件。 ? 應(yīng)答元件（ response element） :與某個專一蛋白因子結(jié)合，從而控制基因特異表達的 DNA上游序列，是順式作用元件的一種。 ? 基因領(lǐng)域效應(yīng)（ gene territorial effect） :染色體上同一方向的兩個基因小于一定距離時，會降低其轉(zhuǎn)錄活性。 ? HBV： 乙肝病毒完整粒子的直徑為 42nm，又稱為 Dane顆粒，由外膜和核殼組成，有很強的感染性。囊膜由脂質(zhì)雙分子層組成，上有纖突蛋白 S(E2)、血凝素脂酶HE(E3)、膜蛋白 M(E1)和小包膜蛋白 E。 ? 基因治療的 ex vivo途徑： 將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體（異種）被 “ 基因工程化的 ”細胞，經(jīng)體外細胞擴增后輸回人體。 cM值越大，兩者之間距離越遠。 ? 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome,YAC）：利用酵母著絲粒載體所構(gòu)建的大片段 DNA克隆載體?？寺∧芰υ?125~150 kb左右，具有載體復(fù)制、拷貝數(shù)控制相關(guān)的序列及篩選標(biāo)記。 b、無組織特異性 一個生物所有組織的組蛋白都相同。 d、組蛋白的修飾作用 H3,H4易發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化等修飾，與基因表達的調(diào)控有關(guān)。 ? 真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點 ①真核生物的基因組遠大于原核生物的基因組 。 ⑥真核基因中存在大量順式作用元件。 ? 原核生物 DNA聚合酶的作用 ? DNA polymerase I:去除 RNA引物，補平缺口，其 5′→ 3′外切酶活性可切除 UV引起的嘧啶二聚體。 ? 真核生物與原核生物 DNA復(fù)制的差異 （ 1）原核 DNA通常具有一個 ori，而真核生物染色體具有很多 ori。 （ 5）真核生物的 DNA聚合酶與原核生物的不同。 d、除了 IS1外，已知 IS都只含有一個開放讀框，通讀則產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶。 真核生物啟動子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 2530區(qū)的TATA box,7080區(qū)的 CAAT box外，大多數(shù)啟動子還含有 GC box。 原核生物的 mRNA以 AUG(或 GUG,UUG)為起始密碼子，而真核生物的 mRNA幾乎都以 AUG為起始密碼子。 ? RNA修飾 有些 RNA，特別是 rRNA和 tRNA，會發(fā)生特異的化學(xué)修飾。 U/A,G。 具體過程： A部位的 AatRNA上游離的 NH2 親核攻擊 P部位 fMettRNAfMet 的酯鍵（ fMetCOOACCtRNA), fMet與 tRNA分開，而與游離的 NH2 形成肽鍵， tRNAfMet游離出。原核生物肽鏈延伸需 EFTu,EFTs,EFG。真核生物只有一種釋放因子 RF. ? RF1識別 UAA,UAG。 （ 3）甲基化。 ? 氯霉素（ chloramphenicol)：阻止 mRNA與核糖體的結(jié)合 ? 四環(huán)素 (tetracycline)：阻止 AatRNA與核糖體的結(jié)合 ? 鏈霉素 (streptomycin)、新霉素 (neomycin)、卡那霉素 (kanamycin)：干擾 AatRNA結(jié)合而產(chǎn)生錯讀，如使編碼 Phe的密碼子 UUU翻譯成 Ile ? 嘌呤霉素（ puromycin):提前釋放肽鏈抑制蛋白合成。 ? 信號肽假說（ signal peptide hypothesis) ? 信號肽（ signal peptide）： 某些新合成蛋白的 N末端含有的 1336Aa組成的氨基酸序列，與該蛋白的跨膜運輸有關(guān)，具有以下特點（ 1）1015個疏水 Aa；（ 2）靠近信號肽 N末端帶有 1個或數(shù)個帶正電荷的 Aa；（ 3） C末端靠近蛋白酶切割位點處帶有數(shù)個極性 Aa,離切點最近的 Aa往往是帶有短側(cè)鏈的 Gly或 Ala。 （ 2）低分子量 GTPase(Ran) 運轉(zhuǎn)過程 （ 1）核運轉(zhuǎn)因子的 α 亞基識別核蛋白的 NLS，并與之結(jié)合。 ? 三引物法實時定量 PCR(Realtime quantative PCR)的技術(shù)原理 除了常規(guī) PCR的兩個引物外，反應(yīng)體系引入與模板DNA互補的第三個引物，該引物的 5’端帶有短波長的熒光基團， 3’端帶有長波長的熒光基團，兩者發(fā)出的熒光相互淬滅，檢測不到熒光。 ? 負(fù)向選擇：若負(fù)選擇基因（如 hsvtk,單純皰疹病毒 胸苷激酶，催化 Gancidovir,即 3二羥 2丙氧甲基鳥嘌呤磷酸化，細胞死亡）置于目的基因外側(cè)，隨機插入，靶基因未被敲除，帶有負(fù)選擇基因表達，正 負(fù)選擇同時啟用，確?？股鼗虿迦牖騼?nèi)部。 （ 5）根據(jù)接頭和 cDNA的已知序列各設(shè)計一條引物，PCR擴增。 （ 4）將 PCR擴增產(chǎn)物克隆到載體，進行測序。利用 DNA重組技術(shù)將酵母轉(zhuǎn)錄因子（ GAL1,GAL4)的 AD基因與 BD基因分別克隆到兩個表達質(zhì)粒上，在 BD基因的插入目的基因，在 AD上游插入 cDNA，最后再構(gòu)建一個插入順式作用元件、 Pmin和報告基因的第三個表達質(zhì)粒。其次，構(gòu)建大片段基因組文庫 ,通過 Southern blotting 找到含 RFLP片段的克隆并測序。Gel retardation assay）： 體外研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法，其原理是：同位素標(biāo)記的 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后分子量變大，電泳時蛋白質(zhì) DNA復(fù)合物較游離DNA的泳動速度變慢，據(jù)此推斷該蛋白質(zhì)與DNA存在相互作用。 蛋白因子對轉(zhuǎn)錄水平的影響 一些調(diào)節(jié)蛋白與啟動子附近的 DNA結(jié)合，引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，或增加或降低。 Lac乳糖操縱子結(jié)構(gòu)： ? lac I: 調(diào)節(jié)基因； Plac: 啟動子； lacO:操縱基因； ? lacZ:β –半乳糖苷酶（分解乳糖成葡糖糖 +半乳糖） ? lacY: β –半乳糖苷透過酶； lacA： β –半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，催化乙酰半乳糖的形成。 ， lacZ, lacY, lacA表達 原因： （ 1） lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合后變構(gòu)，不能結(jié)合在 lacO上， RNA聚合酶與 Plac結(jié)合， lacZ, lacY, lacA轉(zhuǎn)錄。 ? 低濃度 NH3使胞內(nèi) Gln:α –KG的比例下降，胞內(nèi) GlnB蛋白在尿苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下形成 UMPGlnB,而不與NtrB結(jié)合， UMPGlnB 使 NtrC（無活性）磷酸化變成活性形式，與 NtrA, NifA共同促進其它固氮基因的表達。 （ 4）真核細胞中一條成熟 mRNA通常只翻譯出一條多肽鏈；而原核細胞中的 mRNA很多都是多順反子mRNA。 （ 7）真核基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細胞核中，翻譯發(fā)生在細胞質(zhì)中，先轉(zhuǎn)錄后翻譯；而原核基因的表達不存在時空性，邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯。 基因重排與交換 (1) 基因重排： 將一個基因（或基因的一部分）從離啟動子較遠的地方移至離啟動子較近的位點，從而啟動轉(zhuǎn)錄的過程。 （ 2）將模板固定在細胞中的特定位置上，如核基質(zhì)，有利于拓?fù)洚悩?gòu)酶改變 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進 RNA聚合酶與 DNA的結(jié)合與移動。 ? （一） DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特點 螺旋 轉(zhuǎn)折 螺旋（ helixturnhelix, HTH） 蛋白中至少包含 2個 α –螺旋，螺旋與螺旋之間由短側(cè)鏈的氨基酸組成轉(zhuǎn)折，近羧基端的 α –螺旋可與 DNA的大溝結(jié)合。 堿性 螺旋 環(huán) 螺旋（ basic helix/loop/helix, bHLH） 蛋白質(zhì)形成兩個雙性 α –螺旋，螺旋之間為環(huán)狀結(jié)構(gòu)所分開，蛋白質(zhì)氨基端是堿性區(qū)，具有結(jié)合 DNA的能力。 ? 同源域蛋白： 含有同源域的蛋白。 具有富含 Gln的結(jié)構(gòu)，如 SP1 具有富含 Pro的結(jié)構(gòu) . ? 熱激蛋白基因的表達調(diào)控 HSF與 HSE相互作用調(diào)控?zé)峒さ鞍谆虻谋磉_ （ 1）正常溫度： HSF單體存在，且與 Hsp70結(jié)合，無DNA結(jié)合能力，不與 HSE結(jié)合， HSP基因不表達。 （ 2）細胞轉(zhuǎn)化癌基因（ cell oncogene， conc）：正常細胞攜帶的原癌基因，由于突變、重排、缺失、擴增等大量表達引起細胞癌變。當(dāng) LTR插入原癌基因 5’端原有啟動子附近時，引起原癌基因的高水平表達。 二、基因互作與癌基因表達 染色體構(gòu)象對原癌基因表達的影響 原癌基因終產(chǎn)物對基因表達的影響。 外源信號對原癌基因表達的影響?？砷L期潛伏。 ? HBV的復(fù)制 乙肝病毒基因組為雙鏈 DNA，但其復(fù)制并不通過半保留復(fù)制方式，而是通過反轉(zhuǎn)錄途徑。 合成部分（ +） DNA后， RNA引物易位， DNA合成繼續(xù)，形成不完全雙鏈 DNA。 轉(zhuǎn)錄： 以 RNA為模板， RNA依賴的 RNA聚合酶（此時成為轉(zhuǎn)錄酶）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生+RNA(mRNA)。 PB2蛋白 627位氨基酸突變導(dǎo)致人禽流感病毒復(fù)制能力增強 禽流感病毒 PB2蛋白 627位是 Glu, 而人禽流感病毒 PB2蛋白627位是 Lys。 病毒首先以基因組 RNA為模板翻譯出 RNA聚合酶。 ? Ig基因重排與 Ig基因的多樣性 其根本原因是 V區(qū)和 C區(qū)不同片段在 DNA分子水平上發(fā)生了被稱為種系重組的重排。 ? 重鏈基因重排與連接 （ 1） V、 D、 J基因重排 V、 D、 J基因各一拷貝隨機組合，在重排過程中由于 DNA聚合酶或脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用，在 VD或 DJ之間插入一個脫氧核苷酸N， V(N)D(N)J. V、 D、 J基因重排的可能性： 300 20 4 100(N因素 ) 10（連接不精確因素） = 107 Vκ與 Jκ重排也可產(chǎn)生 5 103輕鏈可變區(qū)，輕重鏈結(jié)合可產(chǎn)生 1011可變區(qū)。 進入胚胎發(fā)育階段后， BICOID蛋白由前向后梯度性遞減， NANOS則呈梯度性遞增分布。 spatzl前體定位于卵子的腹側(cè)而不是背側(cè)，因為只有在腹側(cè)的受體能找到配基。這些蛋白在體內(nèi)并不呈均勻分布，而是在空間上被限制在某些表達區(qū)(expression zones)，形成特殊的表達模式。這些基因的表達很有特點，最初在整個胚胎中都有很弱的表達，以后隨著卵裂的進行而逐漸變轉(zhuǎn)成一些不連續(xù)的表達區(qū)帶。成對規(guī)則基因的表達是胚胎出現(xiàn)分節(jié)的最早標(biāo)志之一，它們沿前 后軸形成斑馬紋狀的條帶分布，正好把胚胎分為預(yù)定的體節(jié)。 （ 4）影響果蠅體節(jié)一致性的基因 同源域基因 同源域基因決定軀體體節(jié)命運。 每一輪花器官特征的決定分別依賴于 A、 B、 C三組基因中的一組或兩組基因的正常表達。 A基因與 C基因相互拮抗 . ? 人類基因組計劃的科學(xué)意義在于： （ 1）確定人類基因組中約 56萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。 （ 5）發(fā)現(xiàn)與 DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。