【正文】 物（也叫快速繁殖技術(shù)） 原理： 植物細(xì)胞的全能性 優(yōu)點(diǎn)： 繁殖率高，可大批量生產(chǎn) 取材少 培養(yǎng)周期短 保持優(yōu)良性狀 微型繁殖 作物脫毒 ?病毒在作物體內(nèi)逐年積累，會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差 ?分生區(qū)附近（莖尖、根尖）的病毒極少，甚至沒有 ?采用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng) 人工種子 ? 結(jié)構(gòu)： ? 人工薄膜 +胚狀體（不定芽、頂芽、腋芽） ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 不受氣候、季節(jié)、地域的限制 ? 保留優(yōu)良性狀 ? 時(shí)間短，占地少 ? 技術(shù)： ? 組織培養(yǎng) ? 原理： ? 細(xì)胞全能性 ? 養(yǎng)分、無機(jī)鹽、有機(jī)碳源、農(nóng)藥、抗生素、有益菌 ? 生長調(diào)節(jié)劑 單倍體育種 ? 方法： ? 花藥離體培養(yǎng) ? 技術(shù)： ? 組織培養(yǎng)獲得單倍體 ? 秋水素處理單倍體的幼苗，使染色體加倍 ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 明顯縮短了育種年限 ? 后代穩(wěn)定遺傳 突變體的利用 ?利用組織培養(yǎng)時(shí)，分裂狀態(tài)的細(xì)胞易受培養(yǎng)條件和外界壓力（如射線，化學(xué)物質(zhì)等）的影響而產(chǎn)生突變的原理，誘導(dǎo)并篩選出對(duì)人類有用的突變體。 植物細(xì)胞培養(yǎng)基通常包括 無機(jī)鹽 、 碳源 、 維生素 、生長調(diào)節(jié)素和有機(jī)添加劑 等 。 原生質(zhì)體培養(yǎng) 通常需要大多數(shù)必需維生素 。 有機(jī)酸 加入 丙酮酸 ， 或者檸檬酸 、 蘋果酸和琥珀酸 等三羥酸循環(huán)的中間產(chǎn)物 ， 能夠保證植物細(xì)胞在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基上生長 ， 并且使細(xì)胞對(duì)鉀鹽的耐受能力至少提高到 10mmol/l。 動(dòng)物細(xì)胞工程 應(yīng)用 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞融合 單克隆抗體技術(shù) 核移植 動(dòng)物細(xì)胞工程常用技術(shù) 人耳鼠 “人耳鼠 ” 再出風(fēng)頭 2022年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動(dòng) ——這是有著一對(duì)紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。 人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？ : 20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞融合而成的。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。（分裝前的細(xì)胞培養(yǎng)） ?傳代培養(yǎng) ： 將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)要求 一 體外培養(yǎng)特點(diǎn) : 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞要附在物體上表面生長，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)要求更嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。 器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、 中性硬度玻璃制品。 ？ 提示：無菌、無毒的環(huán)境。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過 39℃ 時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比； ? 人體細(xì)胞在 3940℃1 小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)； ? 在 4041℃1 小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)； ? 4142℃1 小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能； ? 當(dāng)溫度在 43℃ 以上 1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。 ?氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體 主要有氧氣和二氧化碳 。只有滿足了這些基本條件，細(xì)胞才能在體外正常存活、生長。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的控制。 天然 培養(yǎng)基 ? 直接采用取自動(dòng)物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。 ? 水解乳蛋白、膠原 是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。 無血清培養(yǎng)基 ?動(dòng)物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。 5) 細(xì)胞 培養(yǎng)溶液 ?平衡鹽水（ BSS）： Hanks 液和 Earle液是常用的 BSS基礎(chǔ)溶液。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 ?細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。 ?緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及毒好的無菌物品等 風(fēng)淋室 ： 風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品 表面附著的塵埃 ，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。 CO2培養(yǎng)箱 ? 哺乳動(dòng)物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣 ,需要在恒足溫度下才能生存 ,溫差變化一般不應(yīng)超過 ，因此培養(yǎng)箱對(duì)溫度應(yīng)具有較高靈敏度。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各種培養(yǎng)用液。 ?培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，吸管，離心管等。 ?超凈工作臺(tái)消毒 打開紫外線殺菌燈照射消毒 20～ 30分鐘，然后關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺(tái)可保持無菌環(huán)境。 ?燒過的用具均要待冷卻后再接觸組織細(xì)胞。 ?吸取各種用液應(yīng)分別使用吸管，不能混用。 細(xì)胞融合的定義 Cienkawski(1876)、 Buck(1877)、 Geddes(1880)在無脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。 ?20世紀(jì) 80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。 ?體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體 DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下： 1. 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近； 2. 通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透； 3. 兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體； 4. 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。 ?PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬?Engle氏液混合。 ?PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn) ： 其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 三、電融合法 電融合法是 80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。 ? 1）親本 ? 2） 同核體： 同源原生質(zhì)體的融合體 ? 3） 異核體 ：非同源的原生質(zhì)體的融合體 ? 4） 多核體： 含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體 ? 5） 異胞質(zhì)體 ：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。 親本 1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體 親本 2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 在熒光顯微鏡下，親本 1為紅色，親本 2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分 ?4） 利用生長特性篩選法： 利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。 ?親本一：具有卡那霉素抗性但只能在 37度左右生長。 ? 科學(xué)家已經(jīng)在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。 單克隆抗體 由單個(gè) B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為 單克隆抗體。細(xì)胞有兩條基本途徑合成嘌呤核苷酸，一條是從磷酸核糖、氨基酸、CO2和 NH3等化合物開始，葉酸是重要的輔酶，而 氨甲蝶呤 是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞通過這一途徑合成核苷酸。 （二）免疫小鼠 免疫程序是取 6— 8周齡 Balb／ C雌鼠，基礎(chǔ)免疫 2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次， 3— 5天后用于融合。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射 1 l06一 1 107。 （六）融合后細(xì)胞培養(yǎng) (1)融合后 7— 10天用 HAT培養(yǎng)液半量換液 (留一半舊的加一半新的 ) 后每隔 2— 3天 半量換液一次； (2)兩周后可改用 HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用 HAT培養(yǎng)液； (3)2— 3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明； (4)待集落增殖生長至 1／ 3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。 去核卵細(xì)胞 體細(xì)胞核 細(xì)胞核移植 重組細(xì)胞 電脈沖刺激 早期胚胎 (或重組胚胎） 胚胎移植 母體子宮 妊娠、出生 個(gè)體 原理 動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性 卵細(xì)胞 Ａ母綿羊 Ｂ母綿羊 乳腺細(xì)胞 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 細(xì)胞核移植 早期胚胎 卵裂 C母綿羊子宮 胚胎移植 多莉羊 分娩 妊娠 多莉羊的培育過程 融合后的卵細(xì)胞 克隆羊的成功證明了什么？ 動(dòng)物體細(xì)胞核具有全能性； 細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的作用。 。 ?在醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植中的應(yīng)用。 ?在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用